本文關(guān)鍵詞：HGF單克隆抗體的制備及HGF ScFv單鏈抗體的制備

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【摘要】：目的： 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Hepatocyte growth factor,HGF)是一種旁腺體分泌多功能多效性的細(xì)胞因子,主要在肝臟中產(chǎn)生,通過與c-MET受體結(jié)合在腫瘤中發(fā)揮多種作用,能增加趨化運(yùn)動(dòng)和促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)。本研究利用抗體工程技術(shù)制備HGF鼠單克隆抗體和HGF單鏈抗體(single chain variable fragment, ScFv),耦合微納米材料懸臂梁器件,力求開發(fā)出肝癌患者早期血清學(xué)診斷的有效試劑盒。 方法： 1.用本課題組表達(dá)純化的融合蛋白HGF免疫Balb/c小鼠,從而得到能分泌HGF的B細(xì)胞。 2.用細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0融合,用ELISA法篩選 具有分泌功能的單克隆抗體。 3.用ELISA法,Western Blotting方法對(duì)篩選出的單克隆抗體進(jìn)行功能性驗(yàn)證,應(yīng)用HiTrap Protein G HP柱純化抗體。 4.應(yīng)用夾心ELISA法將HGF單克隆抗體用于HCC患者血清的檢測(cè),以及用于懸臂梁納米器件的連接。 5.用PCR法克隆出HGF單抗的重鏈輕鏈可變區(qū)以及Overlap PCR法連接重鏈和輕鏈可變區(qū)。 6.用重組技術(shù)構(gòu)建Payz-HGF ScFv質(zhì)粒,在大腸桿菌16C9中大量表達(dá),應(yīng)用HitrapFF親和層析柱純化HGF ScFv抗體。 結(jié)果： 1.HGF融合蛋白的免疫效果良好,血清學(xué)效價(jià)達(dá)到1：16000。 2.篩選出3株HGF單克隆抗體,分別是HGF H-1(IgG2b), HGF H-2(IgG2a), HGF H-3(IgG1)。 3. HGF H-1(IgG2b), HGF H-2(IgG2a)能很好應(yīng)用于ELISA和Western Blotting對(duì)HGF的檢測(cè)。制備得到HGF H-1、HGF H-2分別為7mg和8mg。 4.用biotin成功標(biāo)記了HGF H-1,應(yīng)用夾心法ELISA法檢測(cè)30例HCC患者血清和30例正常人血清,差異明顯。 5. HGF H-1成功耦合在懸臂梁納米器件,初步得出對(duì)HGF的檢測(cè)限為0.76pg。 6.構(gòu)建了Payz-HGF ScFv質(zhì)粒,表達(dá)純化得到HGF ScFv抗體15mg。 結(jié)論： 1.本研究制備了三株針對(duì)細(xì)胞因子HGF的鼠單克隆抗體,抗體亞型分別為IgG2a, IgG2b, IgG1。 2.本研究初步建立了HGF單克隆抗體夾心法ELISA檢測(cè)試劑盒,并且將抗體用于微納米懸臂梁器件的耦合。 3.本研究制備了HGF ScFv抗體。
【關(guān)鍵詞】：肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子 細(xì)胞因子 單克隆抗體 單鏈抗體 試劑盒
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• ~.略語/符號(hào)說明9-10
• 前言10-14
• 研究現(xiàn)狀、成果10-13
• 研究目的、方法13-14
• 對(duì)象和方法14-31
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料14-15
• 1.2 主要試劑及溶液的配制15-19
• 1.3 主要儀器設(shè)備19
• 1.4 實(shí)驗(yàn)方法19-31
• 結(jié)果31-42
• 2.1 抗HGF鼠單克隆抗體的制備31-34
• 2.2 抗HGF鼠單克隆抗體的純化34
• 2.3 抗HGF鼠單克隆抗體效價(jià)的測(cè)定34-35
• 2.4 抗HGF鼠單克隆抗體的應(yīng)用35-38
• 2.5 ScFv HGF單鏈抗體的制備38-39
• 2.6 ScFv HGF單鏈抗體的制備39-42
• 討論42-45
• 3.1 HGF單克隆抗體的制備及應(yīng)用42-43
• 3.2 HGF ScFv抗體的制備及性質(zhì)的鑒定43-45
• 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明49-50
• 綜述50-68
• 綜述參考文獻(xiàn)61-68
• 致謝68

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Screening and evaluation of human single-chain fragment variable antibody against hepatitis B virus surface antigen[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2006年02期

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本文編號(hào)：963855