本文關(guān)鍵詞：乳鼠坐骨神經(jīng)雪旺細胞體外培養(yǎng)的實驗研究

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【摘要】：目的： 1.探討體外條件下乳鼠雪旺細胞的分離、培養(yǎng)和傳代所需的條件,為進一步的轉(zhuǎn)基因及移植提供種子細胞。 2.觀察不同濃度腦源性生長因子培養(yǎng)環(huán)境下,雪旺細胞增殖與分泌情況。探討腦源性生長因子(BDNF)影響體外培養(yǎng)的雪旺細胞增殖及分泌的實驗研究。 方法： 1.將出生5-7天的乳鼠脫頸處死,在低溫?zé)o菌條件下分離其雙側(cè)坐骨神經(jīng),雙酶消化法制成單細胞懸液,加入10%FBS高糖培養(yǎng)基中,置于預(yù)先鋪有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),采用30分鐘差速貼壁法初步去除成纖維細胞,將所得到的細胞懸液置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),24小時后,向培養(yǎng)基中加入終濃度為10-5/L阿糖胞苷進一步提純雪旺細胞。24小時后換成含有foskilin和牛垂體提取物的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。每日觀察、記錄雪旺細胞的生長狀況,繪制生長曲線。將生長良好的雪旺胞進行傳代,采用免疫熒光技術(shù)對其進行鑒定。 2.取出生5-7天的乳鼠坐骨神經(jīng)的雪旺細胞,分別放入腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子+10%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基中,按培養(yǎng)基中BDNF終濃度為0、10、20、50、100ng/ml,將雪旺細胞設(shè)立為5組培養(yǎng)1周,利用MTT法觀察并比較雪旺細胞的生長增殖情況。ELISA檢測不用濃度BDNF下,雪旺細胞分泌神經(jīng)生長因子(nerve growth factor, NGF).睫狀神經(jīng)節(jié)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor receptor,CNTF)的情況。 結(jié)果： 1.從乳鼠坐骨神經(jīng)中分離出雪旺細胞。倒置顯微鏡下見培養(yǎng)的細胞24后開始貼壁,貼壁細胞多小而圓,較亮,折光較強,不隨液體流動而移動,少量細胞呈雙極索形或三角形,胞核成圓形或橢圓形,較多懸浮細胞。7-8天后,經(jīng)過3次換液。細胞全部貼壁生長,細胞多呈雙極索形,少量細胞呈三角形,相鄰細胞之間以突起相連,或相互平行成束狀排列。傳代后細胞呈雙極索行,貼壁生長。經(jīng)S-100的免疫熒光染色鑒定,雪旺細胞多呈雙極性,相互平行排列,純度最高達80%。 2.BDNF終濃度為50ng/ml、100ng/ml組的雪旺細胞活力明顯高于BDNF終濃度為Ong/ml的雪旺細胞的增殖活力,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而BDNF終濃度為10.20ng/ml組與終濃度為Ong/ml組相比,雖然雪旺細胞的活力有差異但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。另外,雪旺細胞能夠分泌NGF.CNTF,當(dāng)BDNF終濃度為50ng/ml、100ng/ml與BDNF終濃度為Ong/ml比較,雪旺細胞的NGF、CNTF的表達水平明顯增高,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。且當(dāng)BDNF終濃度為50ng/ml時,雪旺細胞的NGF、CNTF的表達水平明顯最高,但與100ng/ml組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。(P0.05) 結(jié)論： 1.利用雙酶消化神經(jīng)組織成單個細胞后、加入阿糖胞苷抑制成纖維細胞生長、再加入foskilin促進雪旺細胞增殖是一種較為快捷、經(jīng)濟、實用的方法,可成功從乳鼠坐骨神經(jīng)中獲取雪旺細胞。經(jīng)免疫熒光染色后,特異性表達S-100的雪旺細胞純化后比例可達80%,可用于進一步的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灮蛞浦病?2.腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對體外培養(yǎng)的雪旺細胞有一定的促進增殖和分泌作用。
【關(guān)鍵詞】：雪旺細胞 體外培養(yǎng) 神經(jīng)營養(yǎng)因子
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-9
• 第一部分 乳鼠雪旺細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定研究9-17
• 1.1 材料9-11
• 1.1.1 實驗動物9
• 1.1.2 主要設(shè)備和儀器9-10
• 1.1.3 主要試劑10
• 1.1.4 主要試劑配制及分裝10-11
• 1.2 方法11-15
• 1.2.1 雙酶消化+差速貼壁法11-12
• 1.2.2 組織塊貼壁法12
• 1.2.3 酶消化+組織貼壁聯(lián)合法12-13
• 1.2.4 原代雪旺細胞的傳代13
• 1.2.5 雪旺細胞的鑒定13-14
• 1.2.6 計數(shù)法繪制雪旺細胞生長曲線14
• 1.2.7 MTT法繪制雪旺細胞增殖情況14
• 1.2.8 雪旺細胞的凍存14
• 1.2.9 實驗中注意事項14-15
• 1.3 結(jié)果15-17
• 1.3.1 雪旺細胞的鏡下觀察15
• 1.3.2 雪旺細胞的免疫熒光鑒定結(jié)果15
• 1.3.3 計數(shù)法雪旺細胞的生長曲線15-16
• 1.3.4 MTT法雪旺細胞的增殖曲線16-17
• 第二部分 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對雪旺細胞增殖和分泌的影響17-25
• 2.1 材料17-18
• 2.1.1 試驗動物17
• 2.1.2 主要設(shè)備和儀器17-18
• 2.1.3 主要試劑18
• 2.2 方法18-20
• 2.2.1 雪旺細胞的原代培養(yǎng)和傳代18-19
• 2.2.2 對雪旺細胞進行不同終濃度BDNF的處理19
• 2.2.3 MTT比色法檢測雪旺細胞增值情況19-20
• 2.2.4 ELISA法檢測不同終濃度的BDNF對雪旺細胞分泌NFG、CNTF的影響20
• 2.3 結(jié)果20-25
• 2.3.1 MTT法檢測不同BDNF終濃度對雪旺細胞的增值及分泌的影響20-22
• 2.3.2 ELISA檢測不同BDNF終濃度下,雪旺細胞分泌NGF、CNTF的水平22-25
• 第三部分 討論25-28
• 1 動物的選擇25
• 2 分離方法的選擇25
• 3 提純方法的選擇25-26
• 4 雪旺細胞生長曲線的解釋26
• 5 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子對雪旺細胞X椫臣胺置詰撓跋，
  
  本文編號：952040
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