本文關(guān)鍵詞：大鼠骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化過程中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達的變化及意義

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【摘要】：背景與目的 骨髓間質(zhì)干細胞(marrow mesenchymal stem cells, MSCs)是一類可以從成熟骨髓、臍帶血及脂肪組織等多種組織分離出來,具有多向分化潛能干細胞。MSCs具有很強的自我增殖、多向分化能力,在特定的條件下可以向不同的細胞進行分化,既可以向中胚層組織分化如骨細胞、心肌細胞等,又可以向外胚層組織分化如神經(jīng)細胞等。MSCs具有來源方便、增殖能力強大、多向分化潛能等優(yōu)點,因此在臨床主要應用于血液系統(tǒng)疾病,心血管疾病,以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷與治療。尤其是在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面,MSCs的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)變性病、中樞神經(jīng)損傷等患者提供了新的治療方法,具有長遠的發(fā)展前景。誘導MSCs向神經(jīng)細胞分化是一種橫向的分化方式,存在著分化效率低、分化調(diào)節(jié)機制不明確等缺點,因此需要進一步研究。 TOR最初是在啤酒酵母的突變株TOR1和TOR2中發(fā)現(xiàn)的,TOR1和TOR2基因編碼兩個大的(280kDa)高度同源的(70%)TOR1和TOR2。1996年,(?)Abraham等在哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了結(jié)構(gòu)和功能保守的TOR,稱為mTOR。mTOR的C末端有一個激酶結(jié)構(gòu)域,約234個氨基酸,因此被認為是磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶(PIKK)蛋白質(zhì)家族成員。在哺乳動物中只有一個mTOR基因,在人、小鼠和大鼠中都編碼2549個氨基酸,目前可以確定的是mTORC1至少包含mTOR、 raptor和mLST8三種蛋白,而mTORC2至少包含mTOR、rictor和mLST8三種蛋白。mTOR的上下游信號轉(zhuǎn)導途徑較為復雜,胰島素、生長因子(胰島素樣生長因子,血小板源性生長因子和表皮生長因子等)合于跨膜胰島素受體或酪氨酸激酶受體(IR,RTK)后,激活Ⅰ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class I PI3K),使PIP被磷酸化為PIP3,PIP3結(jié)合于Akt/PKB和它的活化分子PDK1。mTOR效應器4EBP1和S6Ks, mTOR活性抑制時,促進自噬體形成。PI3K/Akt/mTORCl信號通路是調(diào)控細胞生長與增殖的關(guān)鍵通路,該通路將營養(yǎng)分子、能量狀態(tài)以及生長因子傳來的信號整合在一起,調(diào)控大量的生命過程,包括自噬、核糖體的生物合成和代謝等。 因此本實驗以骨髓間質(zhì)干細胞為研究對象,通過不同濃度mTOR特異性抑制劑雷帕霉素的處理,觀察骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化前后mTOR表達的變化。并初步探討大鼠骨髓間質(zhì)干細胞神經(jīng)分化過程中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表達的變化及意義。 材料和方法 實驗分五組：骨髓間質(zhì)干細胞空白對照組、骨髓間質(zhì)干細胞β-巰基乙醇誘導組、不同濃度雷帕霉素干預骨髓間質(zhì)干細胞組、不同濃度雷帕霉素干預骨髓間質(zhì)干細胞+骨髓間質(zhì)干細胞β-巰基乙醇誘導組、二甲基亞砜(DMSO)陰性對照組,雷帕霉素分3個濃度梯度：10μmol/L20μmol/L30μmol/L。常規(guī)體外培養(yǎng)大鼠MSCs,按照5×104cells/well比例接種于24孔細胞培養(yǎng)板,置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞密度達70%～80%左右加入不同濃度的雷^ 霉素處理液(10～30μmol/L),且每組處理液DMSO濃度均低于0.1%,作用24小時。采用免疫熒光法檢測誘導前后mTOR在細胞內(nèi)的分布,激光共聚焦顯微鏡觀察照相；Western Blot法檢測誘導前后神經(jīng)細胞相關(guān)蛋白和mTOR通路蛋白的表達。 結(jié)果 1、誘導前mTOR主要在骨髓間質(zhì)干細胞細胞核內(nèi)點狀分布,細胞質(zhì)也有少量的分布；誘導后核內(nèi)熒光信號減弱,mTOR向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移。雷帕霉素處理后,隨著雷帕霉素濃度的提高(10～30μmol/L),核內(nèi)熒光信號減弱越明顯,mTOR向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移越明顯。雷帕霉素濃度超過50μmol/L后,細胞形態(tài)變圓,部分細胞脫壁,死亡率顯著增加(P0.05)。 2、β-巰基乙醇可誘導骨髓間質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞,誘導后神經(jīng)細胞Tau蛋白MAP-2蛋白表達顯著增加。雷帕霉素(10～30μmol/L)干預后,隨著雷帕霉素濃度(10～20μmol/L)的提高,Tau蛋白、MAP-2蛋白表達逐漸增加,30μmol/L時Tau蛋白、MAP-2蛋白表達下降(P0.05)。 3、Western blot檢測結(jié)果提示,誘導前后總mTOR表達不變；磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K、磷酸化4EBP1誘導后較誘導前表達下降(P0.05),不同濃度雷帕霉素干預后表達下調(diào)更加顯著(P0.05)。 結(jié)論 mTOR在MSCs神經(jīng)分化過程中由細胞核內(nèi)向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移,活性下降,表達下調(diào),且改變nTOR活性可影響MSCs向神經(jīng)細胞分化。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間質(zhì)干細胞 誘導 神經(jīng)細胞 mTOR 雷帕霉素
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語一覽表12-13
• 1 引言13-15
• 2 材料與方法15-25
• 3 結(jié)果25-30
• 4 討論30-33
• 5 結(jié)論33-34
• 參考文獻34-37
• 綜述37-58
• 參考文獻55-58
• 個人簡歷 在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果58-59
• 致謝59

【共引文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 陳洪菊;唐彬秩;屈藝;母得志;;哺乳動物雷帕霉素靶蛋白參與神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復的研究進展及其延伸意義[J];中國修復重建外科雜志;2012年05期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 姜峰;鈉通道位點3調(diào)制劑BmKI靶向性致痛的信號整合機制研究[D];上海大學;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 李亮;脫氫表雄酮對Aβ_（25-35）小鼠海馬神經(jīng)再生的影響及其分子機制[D];南京醫(yī)科大學;2010年

2 莫秋華;mTOR信號通路參與神經(jīng)病理性疼痛脊髓背角突觸可塑性調(diào)節(jié)的機制[D];中南大學;2011年

3 張振;NAC和雷帕霉素通過抑制鎘誘導神經(jīng)元氧化應激和mTOR通路激活抗凋亡機理研究[D];南京師范大學;2011年

4 楊文茜;脊髓mTOR信號通路在大鼠神經(jīng)病理性疼痛中的作用[D];中南大學;2009年

5 胡凌云;ATP介導Akt/mTOR/p70S6K信號轉(zhuǎn)導通路激活促進大鼠脊髓損傷后運動功能恢復[D];蘭州大學;2010年

6 彭志勇;mTOR信號通路在神經(jīng)病理疼痛大鼠脊髓背角突觸可塑性的作用[D];中南大學;2010年

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本文編號：945086