本文關(guān)鍵詞：改良富血小板血漿對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外增殖及礦化作用的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： 改良富血小板血漿 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖 礦化

【摘要】：背景和目的 1993年Hood等首先提出了富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)的概念[l],PRP是通過(guò)離心全血后得到的血小板濃縮物,含有高濃度生長(zhǎng)因子。不同于原來(lái)造價(jià)昂貴、使用劑量高、有效期限短且無(wú)法有效傳遞至目標(biāo)細(xì)胞的重組人類生長(zhǎng)因子,作為一種自體生物材料,PRP具有制備簡(jiǎn)單、易于操作、價(jià)格低廉、生物安全性高、并發(fā)癥(如疾病傳播和免疫反應(yīng))少等優(yōu)點(diǎn)[4],故被廣大研究者和臨床醫(yī)師公認(rèn)為具有廣闊的應(yīng)用前景。 激活的PRP通過(guò)大量生長(zhǎng)因子如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p (TGF-p)等發(fā)揮聯(lián)合或協(xié)同作用,影響成骨細(xì)胞的趨化、增殖和分化,促進(jìn)骨組織的形成和再生,至今PRP已被成功應(yīng)用于頜骨、顱骨和脊柱的骨移植手術(shù)、心血管手術(shù)和相關(guān)的代謝性骨疾病的治療。 在骨組織工程研究中,尋找能充分發(fā)揮組織再生潛力的支架材料和構(gòu)建生物學(xué)微觀環(huán)境是研究的核心內(nèi)容。Xie,X等的研究表明：PRP可形成一個(gè)網(wǎng)眼樣超微結(jié)構(gòu)組成的3D支架,并能釋放內(nèi)源性生長(zhǎng)因子,且迅速與細(xì)胞結(jié)合。間充質(zhì)干細(xì)胞植于PRP支架后表現(xiàn)出較高的增殖速率、軟骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。在兔的骨缺損模型中植入含有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)的PRP支架也表現(xiàn)出更好的成軟骨方面的大體和組織學(xué)、免疫組織化學(xué)特性,成軟骨相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)增強(qiáng),且可促進(jìn)軟骨下的骨組織再生。 在骨的形成和修復(fù)中骨膜通過(guò)血管形成和提供骨祖細(xì)胞發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Elbackly RM等提出了使用PRP薄膜和自體骨髓來(lái)源BMSCs (PRP/BMSCs凝膠薄膜)作為骨膜替代物圍繞著骨引導(dǎo)支架來(lái)引導(dǎo)骨缺損的再生,研究發(fā)現(xiàn)PRP/BMSCs凝膠薄膜在體外能夠顯著地誘導(dǎo)人內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,并且增加人工培養(yǎng)的BMSCs的骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)表達(dá)；這些細(xì)胞還分泌大量的可溶親血管生成因子如PDGF-BB、VEGF、IL-8等,促進(jìn)血管的形成。最終,PRP/BMSCs凝膠薄膜作為骨膜替代物在免疫抑制小鼠和兔部分骨缺損動(dòng)物模型中,均驗(yàn)證了它在骨膜仿生中發(fā)揮的增強(qiáng)骨再生作用。 劉興文等[8]通過(guò)體外觀察PRP對(duì)自體BMSCs堿性磷酸酶活性的影響,結(jié)果顯示PRP能促進(jìn)BMSCs成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶活性,說(shuō)明PRP能誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化,并且提高BMSCs的分化能力。 但是,也有一些反對(duì)者認(rèn)為PRP沒有或很少有正面的促進(jìn)作用。Aghaloo等[9]在一個(gè)對(duì)兔顱骨缺損修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),PRP加入自體骨移植后組織形態(tài)評(píng)估顯示僅輕度大于單獨(dú)的自體骨移植,并未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。一些研究甚至表明PRP起到了負(fù)面的抑制作用,PRP在免疫功能不全的老鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?減少了脫礦骨基質(zhì)的成骨誘導(dǎo),并且抑制了脫礦骨基質(zhì)的活性。 BMSCs來(lái)源于中胚層,具有很強(qiáng)的自我復(fù)制和橫向分化潛能,大量的研究表明,在體外特定的誘導(dǎo)條件下BMSCs可分化為骨、軟骨、神經(jīng)、脂肪、肌肉及肝等多種功能細(xì)胞,對(duì)間質(zhì)組織如骨、軟骨、肌鍵、脂肪和骨髓基質(zhì)的再生也有重要作用。 Maniatopoulos等首次報(bào)道了從成年大鼠的骨髓獲取的BMSCs,在體外培養(yǎng)條件下能形成鈣化的骨樣組織,經(jīng)X線衍射分折,證實(shí)鈣化組織具有羥基磷灰石樣結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)表明體外培養(yǎng)BMSCs可以向成骨細(xì)胞分化并形成類骨組織。Ouyang等在培養(yǎng)基內(nèi)加入抗壞血酸后發(fā)現(xiàn)BMSCs排列緊密呈片狀生長(zhǎng),將BMSCs片與移植骨片結(jié)合植入受損部位,3周后形態(tài)與組織學(xué)結(jié)果表明,植入物的結(jié)構(gòu)與正常骨膜相似,并向成骨分化。國(guó)內(nèi)諸多研究也證實(shí)BMSCs的體外成骨轉(zhuǎn)化。由于BMSCs免疫原性較弱、培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便、體外增殖迅速、且可被冷凍保存,因此它己成為細(xì)胞及基因治療研究中的種子細(xì)胞,并具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 現(xiàn)階段在BMSCs的體外研究中,細(xì)胞的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增、分化和凍存等一般都需使用含胎牛血清或小牛血清制品,外源性血清的使用,使得干細(xì)胞在骨組織工程及臨床應(yīng)用中存在導(dǎo)致人畜共患疾病傳播的風(fēng)險(xiǎn)。而現(xiàn)有的PRP制備一般需加入外源性物質(zhì)(氯化鈣、人或牛凝血酶等)來(lái)激活血小板,以促進(jìn)大量的生物活性蛋白的產(chǎn)生和釋放,外源性物質(zhì)的加入,使PRP應(yīng)用于臨床及骨組織工程研究中也存在傳染病傳播及免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。段建民等采用液氮凍融的方式激活血小板,制成改良富血小板血漿(modified platelet-rich plasma,mPRP),實(shí)驗(yàn)研究顯示mPRP對(duì)人牙髓細(xì)胞、小鼠成骨細(xì)胞等的增殖具有明顯促進(jìn)作用,并且該作用具有濃度依賴性。與傳統(tǒng)的血小板激活方式相比,液氮凍融不僅可以完好保存血小板內(nèi)生長(zhǎng)因子和生物活性蛋白的活性,而且可以避免因使用人或動(dòng)物等外來(lái)凝血酶而出現(xiàn)傳染性疾病和免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。 本實(shí)驗(yàn)的目的是觀察mPRP對(duì)體外培養(yǎng)的人BMSCs增殖及成骨向分化的作用效果,進(jìn)而為將來(lái)使用mPRP替代外源性血清制品,來(lái)提高骨組織工程中人BMSCs(種子細(xì)胞)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的生物安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 1.mPRP的制備 從提供骨髓的志愿者肘靜脈采集血小板,二次離心法分離獲得PRP,全血細(xì)胞分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)后,將PRP分裝入凍存管內(nèi),液氮反復(fù)凍融3次激活后離心,吸取上清液過(guò)濾用于實(shí)驗(yàn)。 2.人BMSCs的分離和培養(yǎng) 抽取健康志愿者骨髓血5mL,密度梯度離心法分離人BMSCs,連續(xù)3代傳代純化培養(yǎng)。 3.人BMSCs的鑒定 取第三代人BMSCs,以1×105個(gè)／孔的密度接種于6孔板中,待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后分別換為成脂誘導(dǎo)液和礦化誘導(dǎo)液,于誘導(dǎo)第14d、21d后分別進(jìn)行油紅O染色和茜素紅染色。 取人BMSCs懸液行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44、CD105、CD34、 STRO-1。 4.mPRP對(duì)人BMSCs增殖的作用 取生長(zhǎng)良好的人BMSCs,接種至96孔板,分別加入含2%、5%、10%、20%mPRP的a-MEM培養(yǎng)液,含10%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)液作為對(duì)照,隔天每組取4孔,CCK-8法測(cè)定,以時(shí)間為橫軸,OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 5.mPRP對(duì)人BMSCs礦化的作用 取第三代人BMSCs,于不同濃度mPRP礦化誘導(dǎo)液中培養(yǎng)7d,按堿性磷酸酶(ALP)試劑盒要求測(cè)定ALP活性；不同濃度mPRP礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)21d后,茜素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。 6.mPRP對(duì)人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA表達(dá)的作用 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)測(cè)定以不同濃度mPRP礦化培養(yǎng)液培養(yǎng)7d的人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件行單因素方差分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,P0.05為差異有顯著性意義。 結(jié)果 1.PRP血小板計(jì)數(shù) 全血中血小板濃度為187×109L-1, PRP中血小板濃度為1001×109L-1,約為全血濃度的5.4倍。 2.人BMSCs的生長(zhǎng)和純化 人BMSCs培養(yǎng)48h后可見少量細(xì)胞貼壁,細(xì)胞呈梭形,培養(yǎng)10d后細(xì)胞增生為成纖維樣,有少許不規(guī)則突觸,呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)。約2周后細(xì)胞達(dá)到80%左右融合,連續(xù)培養(yǎng)至第3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)較均一,呈長(zhǎng)梭形,胞核居中。 3.人BMSCs的鑒定結(jié)果 人BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)2周后油紅O染色可見胞漿內(nèi)含有橙紅色融合脂滴；經(jīng)成骨誘導(dǎo)3周后,茜素紅染色可見紅色礦化結(jié)節(jié)形成。 人BMSCs中CD44、CD105和STOR-1表達(dá)為陽(yáng)性,而CD34表達(dá)為陰性,符合人BMSCs表面標(biāo)記物一般表型。 4.mPRP對(duì)人BMSCs增殖的作用 在不同濃度mPRP培養(yǎng)液培養(yǎng)下,人BMSCs于第4d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,5%-10%的mPRP組與對(duì)照組(10%FBS組)相比較,在培養(yǎng)第6d、8d均促進(jìn)了人BMSCs的增殖,其中以10%mPRP濃度組尤為明顯。 5.mPRP對(duì)人BMSCs礦化的作用 5%和10%濃度的mPRP均顯著提高了礦化培養(yǎng)7d后人BMSCs的ALP活性；連續(xù)礦化培養(yǎng)21d后,5%mPRP組中茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)面積比顯著大于對(duì)照組(10%FBS組)。 6.mPRP對(duì)人BMSCs中OCN和RUNX-2mRNA表達(dá)的作用 RT-PCR顯示5%濃度mPRP培養(yǎng)的人BMSCs礦化誘導(dǎo)組OCN和RUNX-2mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著上調(diào)。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)的人BMSCs具有干細(xì)胞特性,表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物,且具有成骨向、成脂向分化能力。與胎牛血清比較,5%-10%的mPRP顯著促進(jìn)了人BMSCs的增殖,其中以10%濃度組尤為顯著；5%的mPRP具有促進(jìn)人BMSCs成骨向分化的作用。結(jié)果表明mPRP在體外促進(jìn)人BMSCs增殖與分化的作用具有濃度特異性,將自體來(lái)源mPRP用于以人BMSCs為種子細(xì)胞的骨組織工程中具有較高的生物安全性。
【關(guān)鍵詞】：改良富血小板血漿 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 增殖 礦化
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-21
• 第一章 人BMSCs的體外培養(yǎng)和鑒定21-37
• 1 材料21-24
• 2 方法24-28
• 3 結(jié)果28-32
• 4 討論32-37
• 第二章 mPRP對(duì)人BMSCs體外增殖和免疫原性的作用37-46
• 1 材料37-38
• 2 方法38-40
• 3 結(jié)果40-43
• 4 討論43-46
• 第三章 mPRP體外培養(yǎng)對(duì)人BMSCs成骨向分化的作用46-61
• 1 材料46-48
• 2 方法48-53
• 3 結(jié)果53-58
• 4 討論58-61
• 全文總結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 英文縮略詞簡(jiǎn)表66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間主要成果67-68
• 致謝68-70

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 劉興文,劉宏偉,張秀白,劉蘭寧,王湞,常秀梅;富血小板血漿PRP對(duì)骨髓基質(zhì)細(xì)胞BMSCs堿性磷酸酶活性和總蛋白含量的影響[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年05期

2 李芳;郭青;張翼;趙丹丹;許雯;夏冰;;間充質(zhì)干細(xì)胞和Stro-1~+亞群免疫抑制的比較及IDO1、IDO2在其中的作用[J];天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2012年02期

3 吳軍;張燕燕;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用進(jìn)展[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2007年50期

4 周海洋;王宸;耿震;;自體富含血小板血漿對(duì)兔骨折愈合的影響[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年24期

5 李洪濤;段建民;片山直;;富血小板血漿與洗滌血小板對(duì)人牙髓細(xì)胞礦化的作用[J];中國(guó)組織工程研究;2012年07期

6 段建民;菊地寬高;汪維健;片山直;;血小板血漿對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2006年04期

7 李洪濤;段建民;張宏斌;片山直;;液氮凍融洗滌血小板對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖的影響[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2010年06期

8 李明;張長(zhǎng)青;袁霆;陳圣寶;呂汝舉;;富血小板血漿制備套裝的評(píng)估研究[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2011年01期

，

本文編號(hào)：939913