本文關鍵詞：syk、JNK調控單核細胞增生李斯特菌感染過程中炎癥復合體活化機制的研究

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【摘要】：目的 探討脾源性酪氨酸激酶syk信號通路以及胞內其它常見蛋白激酶(如JNK,P38MAPK以及P13K等)信號通路在單增李斯特菌(LM)感染小鼠腹腔巨噬細胞過程中對炎癥復合體活化與裝配的作用。 方法 將小鼠腹腔巨噬細胞隨機分為BAY處理組、SP處理組、SB處理組、WO處理組、未處理組以及陰性對照組(NI),每組設3個復孔。BAY處理組、SP處理組、SB處理組、WO處理組分別用syk抑制劑BAY117082,JNK抑制劑SP600125,P38MAPK抑偉制劑SB203580以及P13K抑制齊wotamine預處理小鼠腹腔巨噬細胞1h,除陰性對照組外,其余各組巨噬細胞感染野生型LM (WT-LM)24h, ELISA檢測上清液中白細胞介素(IL)-18表達水平；免疫熒光觀察細胞內炎癥復合體的關鍵蛋白組分細胞凋亡相關蛋白ASC斑點(ASC-speck)的形成情況；Westernblot檢測WT-LM感染小鼠腹腔巨噬細胞不同時相點蛋白syk以及JNK的磷酸化水平變化情況,同時使用LM的△hly和△hly::hly突變株感染細胞觀察syk以及JNK蛋白的磷酸化水平變化。同時利用NLRP3炎癥復合體的特異刺激物(ATP)刺激BAY處理組與SP處理組巨噬細胞3h,ELISA檢測上清液中IL-18的水平；免疫熒光觀察細胞內ASC-speck的形成情況；使用AIM2炎癥復合體特異刺激物(Poly(dA：dT))及IPAF炎癥復合體特異刺激物(鞭毛蛋白-flagellin)分別刺激SP處理組細胞,ELISA檢測上清液中IL-18的表達水平。 結果 BAY處理組小鼠腹腔巨噬細胞感染LM后IL-18的表達水平與未處理組相比明顯降低(P0.05),其它幾種蛋白激酶抑制劑處理組中,只有SP處理組IL-18的表達水平與未處理組相比明顯降低(P0.05),而且降低的程度與BAY處理組相似,而SB處理組和WO處理組小鼠腹腔巨噬細胞的IL-18表達水平與未處理組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05),免疫熒光結果顯示BAY處理組與SP處理組小鼠腹腔巨噬細胞經LM刺激后,胞內ASC-speck陽性的細胞百分比均明顯低于未處理組(P0.01)。Western b1ot結果表明野生型LM感染過程中JNK的磷酸化水平10min時明顯升高,在40min時達到最高水平,持續(xù)至少120min,同時syk的磷酸化水平在感染5min即可被檢測到,進一步證實syk與JNK在LM感染過程中發(fā)揮著重要的作用。LM的△hly和△hly::hly突變株感染巨噬細胞過程中,JNK蛋白的磷酸化水平在△hly突變株感染后40min仍有顯著表達,但在80min和120min出現(xiàn)驟然減弱,而syk磷酸化水平表達趨勢發(fā)生變化,野生型LM和△hly: hly-LM感染組,p-syk的表達高峰均出現(xiàn)在感染后15min,在30min時表達量均減少,而△hly-LM感染組p-syk的表達高峰與野生型LM組p-syk的表達高峰相比,出現(xiàn)高峰延遲,高峰時間點出現(xiàn)在感染后30min時,結果表明,syk與JNK信號通路在調節(jié)LM感染后炎癥復合體的過程中,LM的主要毒力因子LLO可能是其重要的調控靶點。為進一步探究JNK和syk信號通路是否特異性的促進LM感染過程中炎癥復合體的活化,ATP刺激BAY處理組及SP處理組后發(fā)現(xiàn),只有SP處理組的IL-18表達水平及胞內ASC-speck的百分比數(shù)量與未處理組相比明顯降低(P0.05),而BAY處理組的IL-18表達水平與未處理組相比無明顯變化；Poly(dA：dT)及鞭毛蛋白分別刺激SP處理組后,結果顯示Poly(dA：dT)刺激實驗中,SP處理組的IL-18表達水平明顯降低(P0.05),而鞭毛蛋白刺激實驗中的SP處理組IL-18水平與未處理組相比,差異無統(tǒng)計學意義。 結論 綜上所述,syk信號通路及JNK信號通路參與調控單增李斯特菌感染過程中炎癥復合體的活化,而且在調節(jié)過程中,syk和JNK蛋白磷酸化變化水平與LLO密切相關。而且,syk信號通路特異性地調控LM感染中炎癥復合體的活化,而JNK信號通路可能非特異性參與NLRP3以及AIM2炎癥復合體形成的過程中。
【關鍵詞】：syk JNK 單增李斯特菌 炎癥復合體 白細胞介素(IL)-18
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378;R3416
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 目錄8-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-18
• 研究現(xiàn)狀、成果11-17
• 研究目的、方法17-18
• 1 對象和方法18-27
• 1.1 實驗動物18
• 1.2 常規(guī)試劑和耗材18-19
• 1.3 各實驗所需主要試劑及溶液的配制19-23
• 1.4 實驗儀器和設備23-24
• 1.5 方法24-26
• 1.5.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離純化24
• 1.5.2 LM野生株EGD和突變株的增殖與保存24
• 1.5.3 ELISA檢測24-25
• 1.5.4 免疫熒光檢測25-26
• 1.5.5 免疫印跡檢測26
• 1.6 統(tǒng)計學方法26-27
• 2 結果27-34
• 2.1 不同抑制劑對LM感染小鼠巨噬細胞產生IL-18水平的影響27-28
• 2.2 SP處理和BAY處理對LM感染巨噬細胞胞漿內ASC-speck形成個數(shù)的影響28-29
• 2.3 LM感染不同時相點syk及JNK的蛋白磷酸化表達水平29-30
• 2.4 LLO在LM感染形成炎癥復合體中的作用30-31
• 2.5 LLO對LM感染后syk及JNK蛋白磷酸化水平的影響31-32
• 2.6 syk和JNK信號通路在其他特異刺激物誘導的炎癥復合體活化中的作用32-34
• 3 討論34-38
• 結論38-39
• 參考文獻39-44
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明44-45
• 綜述 炎癥復合體在病原微生物感染中活化機制的研究進展45-54
• 綜述參考文獻51-54
• 致謝54

【參考文獻】

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中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前1條

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本文編號：926164