本文關鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應的影響

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【摘要】：目的：通過建立傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi, S.typhi)感染的細胞模型,用自噬阻斷劑氯喹(chloroquine, CQ)和Beclin1過表達技術,研究傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98對人巨噬細胞THP-1自噬、凋亡和炎癥反應的影響,為進一步闡明該質(zhì)粒增強宿主菌毒力的分子機制提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞THP-1自噬過程的影響 1.CQ對THP-1細胞自噬阻斷濃度的確定 CQ是一種治療瘧疾的藥物,近年來被廣泛用作自噬阻斷劑,它通過提高溶酶體的pH值使酸性水解酶失活,導致自噬溶酶體無法分解底物,造成自噬相關蛋白的累積。本實驗以0、10、20、30、40、50、60、70和80μM CQ的培養(yǎng)液作用THP-1細胞6h,用蛋白質(zhì)印跡技術(western blot, WB)檢測自噬底物蛋白p62的累積水平;作用細胞24h后,用噻唑藍還原法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)檢測細胞存活率。 2.CQ對受試菌的影響 用上述方法測定的CQ適宜濃度作用受試菌24h,OD600測定菌液濃度,檢測該濃度CQ對細菌的影響。 3.CQ對THP-1細胞感染模型自噬的影響 由于傷寒沙門菌只感染人類的嚴格宿主特異性,本實驗以攜帶傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98的野生株ST8、消除pRST98的突變株ST8-ΔpRST98和將pRST98經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導入的回補株ST8-c-pRST98為受試菌,分別與人巨噬細胞THP-1共培養(yǎng)建立感染模型。用對數(shù)生長期細菌按感染復數(shù)(multiplicity of infection, MOI)50：1感染細胞,同時設立自噬阻斷劑CQ干預組。將細菌與細胞共作用1h后吸取上清,加入含100μg/ml的阿米卡星(amikacin, AMK)培養(yǎng)液作用2h以去除胞外菌,將AMK濃度降為10μg/ml以抑制從感染細胞中釋放至培養(yǎng)液中的細菌生長。分別在感染的1h和3h收獲細胞：①WB檢測細胞自噬標志蛋白——微管相關蛋白1輕鏈-Ⅱ (microtubule-associated protein1light chain3-II,MAP1-LC3-II)及自噬底物蛋白p62表達;②將帶有紅色和綠色熒光的mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細胞后,用共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)觀察細胞自噬體及自噬溶酶體的變化。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞THP-1凋亡和炎癥反應的影響 beclin1基因是第一個被確認的哺乳動物自噬調(diào)控基因,其編碼產(chǎn)物Beclin1是自噬發(fā)生的標志蛋白。本部分實驗用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將外源性beclin1基因?qū)隩HP-1細胞,研究Beclin1蛋白過表達后傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞凋亡及炎癥反應的影響。感染模型建立同第一部分,分別設野生株ST8、突變株ST8-ApRST98和回補株ST8-c-pRST98感染的Beclin1過表達組及對照組,共6組。在感染后1h、3h、5h、9h和13h收獲細胞：①WB檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Beclin1表達效率;②Annexin.V-FITC/Propidium Iodide (Ann.V/PI)雙染流式細胞術(flow cytometry,FCM)分析細胞凋亡率;③酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assayELISA)檢測細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-18(interleukin-18, IL-18)和白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)。 結果： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞THP-1自噬過程的影響 1.WB檢測自噬底物蛋白p62結果顯示,30μMCQ作用THP-1細胞6h后,p62已出現(xiàn)明顯累積(p0.01),40μMCQ作用細胞6h后,累積程度達到飽和。MTT法檢測結果顯示，30μM和40μMCQ作用細胞24h后存活率分別為58.58%和46.03%。 2.OD600測定菌液濃度結果顯示,與對照組相比,30μMCQ對3株受試菌菌量未見明顯影響。參照文獻,30μMCQ作用THP-1細胞6h,自噬底物蛋白p62出現(xiàn)明顯累積,作用細胞24h后,細胞存活率超過50%,且對細菌未見明顯影響,因此將30μM作為CQ的后續(xù)工作濃度。 3.WB檢測自噬標志蛋白LC3-Ⅱ和底物蛋白p62結果顯示,細菌與細胞共作用1h,CQ干預組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值明顯高于對照組(p0.01),其中突變株ST8-ApRST98LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值的增加量均高于野生株ST8及回補株ST8-c-pRST98(p0.05)。細菌與細胞共作用3h,CQ干預組LC3-Ⅱ/β-actin值及p62/β-actin值較對照組上升(p0.05),但突變株ST8-ΔpRST98的上升量仍顯著高于野生株ST8及回補株ST8-c-pRST98(P0.01)。 4.用mRFP-GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染THP-1細胞后,CLSM檢測結果顯示,細菌與細胞共作用1h,CQ干預組突變株ST8-ΔpRST98感染細胞的點狀聚集物數(shù)量高于對照組,而野生株ST8和回補株ST8-c-pRST98感染細胞中未見顯著差異。細菌與細胞共作用3h,CQ干預組3株菌感染細胞的點狀聚集物數(shù)量均高于對照組,其中突變株ST8-ΔpRST98的上升量顯著高于野生株ST8及回補株ST8-c-pRST98(P0.01)。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細胞THP-1凋亡和炎癥反應的影響 1.FCM檢測細胞凋亡率結果顯示,Beclin1蛋白過表達組,在細菌與細胞共作用的1h、3h、5h和9h,野生株ST8、回補株ST8-c-pRST98及突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細胞的凋亡率均上升;細菌與細胞共作用13h,野生株、回補株與突變株感染THP-1的凋亡率未見顯著性差異。對照組在細菌與細胞共作用的1h和3h,凋亡率未見顯著差異。細菌與細胞共作用5h、9h和13h,突變株ST8-ΔpRST98感染THP-1細胞凋亡率低于野生株ST8和回補株ST8-c-pRST98感染組(p0.05),且隨時間延長愈加明顯。 2.ELISA檢測細胞因子結果顯示,細菌和細胞共作用1h、3h和5h,Beclin1過表達組及對照組突變株感染細胞的IL-1β及IL-18表達水平高于野生株和回補株(p0.05),而突變株感染細胞的IL-10表達水平低于野生株和回補株(p0.05)。但細菌與細胞共作用9h后,野生株、回補株與突變株感染細胞的IL-1β、IL-18和IL-10表達水平未見顯著差異。細菌和細胞共作用1h、3h和5h,Beclin1蛋白過表達組較對照組3株受試菌感染THP-1細胞的IL-1β及IL-18表達水平上升,而IL-10表達水平下降。細菌與細胞共作用9h,3株受試菌感染THP-1細胞IL-1β、IL-18和IL-10表達水平未見顯著差異。 結論： 1.CQ干預前后,比較THP-1細胞自噬過程中自噬標志蛋白LC3-Ⅱ、底物蛋白p62、自噬體和自噬溶酶體的實驗結果顯示傷寒沙門菌質(zhì)粒pRST98作用在THP-1細胞自噬過程的前期,早于溶酶體降解的過程。 2. Beclin1作為自噬標志蛋白,過表達后可上調(diào)沙門菌感染細胞的自噬水平及凋亡率,加劇細胞炎癥反應并最終影響感染的結局。
【關鍵詞】：傷寒沙門菌 質(zhì)粒 巨噬細胞 自噬 CQ Beclin1
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 引言13-17
• 主要技術路線16-17
• 第一部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對人巨噬細胞THP-1自噬過程的影響17-31
• 1 材料與方法17-22
• 2 結果22-29
• 3 討論29-31
• 第二部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對THP-1凋亡和炎癥反應的影響31-44
• 1 材料與方法31-35
• 2 結果35-41
• 3 討論41-44
• 小結44-45
• 參考文獻45-48
• 綜述 巨噬細胞在沙門菌感染中作用的研究新進展48-56
• 參考文獻53-56
• 英文縮略詞表56-58
• 攻讀學位期間本人公開發(fā)表的論文58
• 本課題所獲基金資助58-59
• 致謝59-60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前8條

1 祁汝峰;顧冠彬;黃瑞;;傷寒沙門菌耐藥質(zhì)粒體內(nèi)接合轉(zhuǎn)移的研究[J];微生物與感染;2007年03期

2 吳淑燕;李瓊;儲元元;李Z腦，

本文編號：921308