本文關(guān)鍵詞：人分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑在果蠅細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)及鑒定

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【摘要】：目的：人分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑（secretory leukocyte protease inhibitor，SLPI）也叫抗白細(xì)胞蛋白酶（antileukoprotease, ALP）或分泌性蛋白酶抑制劑（mucousprotease inhibitor, MPI），為黏膜上皮細(xì)胞分泌的非糖基化單鏈多肽蛋白，是一種嗜中性彈性蛋白酶陽離子抑制劑，具有抗細(xì)菌、抗人類免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiency virus, HIV）、抗炎癥因子和誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化等生物學(xué)功能，對創(chuàng)傷組織的愈合也具有重要作用。近來，作為一種潛在的黏膜佐劑，人SLPI在增強(qiáng)黏膜免疫方面的作用引起人們的關(guān)注，因此，我們想應(yīng)用果蠅表達(dá)系統(tǒng)，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的方式篩選出能穩(wěn)定表達(dá)人SLPI蛋白的多克隆細(xì)胞系，并對其生物學(xué)活性進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步開展了解人SLPI在抗病毒感染及其免疫佐劑等方面的作用奠定基礎(chǔ)。 方法：首先從A549細(xì)胞中提取細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。根據(jù)人SLPI基因序列，設(shè)計上、下游兩個引物，并分別加入KpnⅠ和EcoRⅠ兩個酶切位點。利用PCR技術(shù)，以A549的cDNA為模板擴(kuò)增SLPI的開放讀碼框（open readingframe, ORF）。然后利用DNA重組技術(shù)將PCR基因產(chǎn)物克隆入果蠅S2細(xì)胞表達(dá)載體pMT/V5-HisA中，得到pMT-SLPI真核表達(dá)載體。應(yīng)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)將pMT-SLPI與含有潮霉素B抗性基因的篩選質(zhì)粒pCoHygro以共轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞，然后用含有300g/ml潮霉素B的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每4-5d更換抗性培養(yǎng)液，大約3-4周便可產(chǎn)生抗性細(xì)胞克隆。對克隆細(xì)胞加入終濃度為500M的CuSO4誘導(dǎo)表達(dá)48h后，收集細(xì)胞上清行Western blot檢測重組蛋白的表達(dá)。并利用RT-PCR的方法檢測SLPI在克隆細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平。對不同誘導(dǎo)時間后的細(xì)胞上清進(jìn)行Western blot檢測以確定誘導(dǎo)的最佳時間。誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清濃縮后行胰蛋白酶抑制實驗，以觀察果蠅S2細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白是否具有良好的生物學(xué)活性。 結(jié)果：采用RT-PCR技術(shù)從A549細(xì)胞中得到人SLPI基因ORF，通過EcoRⅠ和KpnⅠ雙酶切位點將人SLPI基因ORF序列插入到表達(dá)載體中，成功構(gòu)建了人SLPI的真核表達(dá)載體。與抗性篩選質(zhì)粒pCoHygro共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞后在含有潮霉素的培養(yǎng)液中篩選3-4周，得到能穩(wěn)定表達(dá)人SLPI蛋白的多克隆細(xì)胞系，并命名為S2/SLPI。應(yīng)用CuSO4對S2/SLPI進(jìn)行誘導(dǎo)并對誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清通過Western blot檢測，可得到大小為12kDa左右的特異性條帶，證實目的蛋白的表達(dá)，并通過對不同誘導(dǎo)時間段的細(xì)胞上清行Western blot檢測，確定誘導(dǎo)該蛋白的最佳時間為24h。生物學(xué)活性分析顯示人SLPI能抑制胰蛋白酶的活性。 結(jié)論：利用RT-PCR方法成功克隆了人SLPI基因ORF，并利用果蠅表達(dá)系統(tǒng)篩選到可分別穩(wěn)定表達(dá)人SLPI蛋白的多克隆細(xì)胞株。S2/SLPI穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立為進(jìn)一步開展人SLPI促進(jìn)免疫應(yīng)答及其在抗病毒感染等方面的作用研究提供了重要基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：人SLPI 果蠅表達(dá)系統(tǒng) 穩(wěn)定表達(dá) 生物學(xué)活性
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 實驗設(shè)計與流程11-12
• 前言12-15
• 實驗材料15-19
• 實驗方法19-30
• 結(jié)果30-36
• 討論36-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 附錄41-42
• 致謝42-43
• 綜述43-50
• 參考文獻(xiàn)48-50

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本文編號：897755