本文關鍵詞：小腸結腸炎耶爾森菌生物學特性和分子分型研究

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【摘要】：【研究背景】 小腸結腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)是一種革蘭氏陰性無芽孢桿菌,屬于耶爾森菌屬,是該菌屬的三大致病菌之一。小腸結腸炎耶爾森菌廣泛存在于自然環(huán)境中,主要通過污染食物進入人體。人感染小腸結腸炎耶爾森菌后,主要表現(xiàn)為胃腸道癥狀,如嘔吐、腹痛、腹瀉等,多具有自限性。但是,部分患者可出現(xiàn)一系列嚴重的并發(fā)癥,如心內(nèi)膜炎、反應性關節(jié)炎、組織膿腫等,甚至引起敗血癥導致死亡。在歐洲,由該菌和假結核耶爾森菌引起的耶氏菌病在常見的人畜共患病中占第四位；在美國,由該菌引起的疾病每年發(fā)病約11.7萬例；在我國,文獻可查的小腸結腸炎耶爾森菌暴發(fā)有兩次。該菌可分為6個生物型(1A,1B和2～5)和60個血清型,主要通過檢測ail、ystA、ystB、yadA和virF5個毒力基因來判斷其致病性。小腸結腸炎耶爾森菌對青霉素和一代頭孢天然耐藥,對其他種類的抗菌藥物具有不同程度的耐藥率。脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)分型是現(xiàn)階段小腸結腸炎耶爾森菌分子分型最常用的方法,主要用于菌株的溯源。 山東省自2006年開始,設立高密市和五蓮縣兩個監(jiān)測點對小腸結腸炎耶爾森菌開展監(jiān)測,至2011年共從雞、牛、羊、豬等動物糞便和生熟肉、蒼蠅中分離到小腸結腸炎耶爾森菌237株。這些菌株的動力、生物型、血清型、毒力基因和抗菌藥物敏感性等生物學特性尚缺乏系統(tǒng)性的研究分析,分子分型也尚未開展。 【研究目的】 1、系統(tǒng)分析分離到的小腸結腸炎耶爾森菌的動力、生物型、血清型、毒力基因和抗菌藥物敏感性等生物學特性及其時間、地區(qū)和宿主分布特點。 2、對分離到的小腸結腸炎耶爾森菌進行PFGE分型,了解菌株的親緣關系,探討表型分型和PFGE分型的相互關系。 3、初步建立山東省小腸結腸炎耶爾森菌的基礎數(shù)據(jù)庫,為該菌的長期監(jiān)測奠定基礎,為耶氏菌病的預測、預警提供技術支持。 【研究方法】 1、動力試驗采用半固體穿刺法,生物分型根據(jù)生化反應進行判斷,血清分型采用玻片凝集法,毒力基因檢測采用PCR法,抗菌藥物敏感性檢測采用VITEK2COMPACT系統(tǒng)和AST-GN16藥敏卡。 2、PFGE分型參照PulseNet China推薦的標準方法進行,電泳圖譜處理及聚類分析采用BioNumerics6.1軟件。 3、資料的錄入、整理和簡單分析采用Excel2007軟件,數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析采用SPSS16.0軟件。 【研究結果】 1、動力為“中”的菌株占4.2%(10/237),動力為“差”的菌株占3.0%(7/237),其余菌株動力良好。動力為“中”或“差”的菌株在各年份、各地區(qū)和多種宿主中均有分布。 2、98.7%(234/237)的菌株為生物1A型；其余3株菌為生物4型,均從2006年高密市的豬糞樣本中分離到。 3、49.8%(118/237)的菌株凝出相應血清型,以0：5(21.9%,52/237)和O：8(21.1%,50/237)型為主。2011年可分血清型最多(5種)；高密分離株0：5型最多(23.9%,39/163),五蓮分離株0：8型最多(33.8%,25/74)；各宿主分離株均以O：5和O：8型為主。 4、ystB基因的陽性率最高,為81.4%(193/237)；ail和ystA基因僅在3株菌中檢測到,陽性率為1.3%(3/237)；未檢測到y(tǒng)adA和virF基因。ystB基因陽性菌株在不同時間、地區(qū)和宿主中均為優(yōu)勢菌株。 5、共有235株菌獲得抗菌藥物敏感性試驗的結果。菌株對頭孢曲松、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素和替加環(huán)素的敏感率最高,為100%；對氨芐西林的耐藥率最高,為94.5%(222/235)。菌株的多重耐藥率為12.3%(29/235)。2007和2011年分離株對呋喃妥因的敏感情況有差異(P0.05)；高密市分離株對復方新諾明的耐藥率(10.4%,17/163)高于五蓮縣分離株(1.4%,1/72)(P0.05)；毒力基因A型(ail-ystA-ystB+yadA-virF-)菌株對氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢唑林、頭孢西丁的耐藥率和對呋喃妥因的中介耐藥率(依次為99.0%,190/192；89.6%,172/192；94.8%,182/192；80.2%,154/192；94.8%,182/192)高于毒力基因B型(ail-ystA-ystB-yadA-virF-)菌株(依次為72.5%,29/40；65.0%,26/40；67.5%,27/40；42.5%,17/40；65.0%,26/40)(P0.05)。 6、237株菌中的231株被分為144個PFGE型別,相似性系數(shù)在61.1%～100.0%,無明顯優(yōu)勢型別。五蓮分離株的PFGE聚集性高于高密分離株,含7株及以上菌株的PFGE型別均出現(xiàn)在五蓮縣。其余6株菌未獲得PFGE條帶。144個PFGE型別中有15個型別在中國疾控中心數(shù)據(jù)庫中可找到相同或相近的型別。 7、17株動力為“中”或“差”的菌株中的14株形成3個聚類簇；52株0：5血清型菌株中的31株形成4個聚類簇,50株0：8血清型菌株中的19株形成1個聚類簇；41株毒力基因B型(ail-ystA-ystB-yadA-virF-)菌株中的20株形成1個聚類簇；藥敏型別在PFGE聚類中分布分散,無特異性。 8、動力、生物分型、血清分型、毒力基因分型、藥敏分型和PFGE分型的Simpson指數(shù)分別為0.1362、0.0251、0.6564、0.3081、0.7214和0.9982。 [結論] 1、高密市和五蓮縣的小腸結腸炎耶爾森菌存在動力突變株；菌株幾乎全為生物1A型；血清型以0：5和0：8型為主,存在地區(qū)差異；菌株攜帶的毒力基因主要為ystB基因,無傳統(tǒng)致病性菌株；耐藥譜廣泛,大部分菌株對青霉素類和一、二代頭孢耐藥,存在一定的多重耐藥現(xiàn)象,vstB基因陽性的生物1A型菌株與ystB基因陰性的生物1A型菌株耐藥性不同。 2、高密市和五蓮縣的小腸結腸炎耶爾森菌存在多克隆系,基因多態(tài)性明顯,部分克隆株長期存在,五蓮地區(qū)可能存在相對優(yōu)勢克隆系；部分山東分離株可能與其他省份菌株存在聯(lián)系。 3、小腸結腸炎耶爾森菌的PFGE分型可能與其動力有一定相關,與生物型、血清型、毒力基因型和藥敏型別不具有相關性。 4.PFGE具有強大的分型能力,但在菌株溯源時需與表型分型聯(lián)合使用。
【關鍵詞】：小腸結腸炎耶爾森菌 動力 毒力基因 抗菌藥物敏感性 脈沖場凝膠電泳
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.2
【目錄】：

• 目錄4-6
• CONTENTS6-8
• 中文摘要8-12
• Abstract12-16
• 符號說明16-18
• 前言18-26
• 1 概述18-24
• 1.1 病原學18-19
• 1.2 流行病學19-21
• 1.3 毒力基因21-22
• 1.4 抗菌藥物敏感性22
• 1.5 分子分型22-24
• 2 研究的目的和意義24
• 3 技術路線圖24-26
• 材料與方法26-37
• 1 實驗材料26-28
• 1.1 研究對象26
• 1.2 實驗試劑26-27
• 1.3 主要儀器27-28
• 1.4 所用軟件28
• 2 方法28-35
• 2.1 動力試驗28
• 2.2 生物分型28-29
• 2.3 血清分型29
• 2.4 毒力基因檢測29-30
• 2.5 抗菌藥物敏感性檢測30
• 2.6 PFGE分型30-34
• 2.7 數(shù)據(jù)處理與分析34-35
• 3 質量控制35-37
• 3.1 設計階段35-36
• 3.2 實驗實施階段36
• 3.3 資料分析階段36-37
• 結果37-59
• 1 動力試驗37
• 2 生物分型37
• 3 血清分型37-39
• 3.1 不同年份菌株的血清型分布38
• 3.2 不同地區(qū)菌株的血清型分布38
• 3.3 不同宿主菌株的血清型分布38-39
• 4 毒力基因檢測39-41
• 4.1 不同年份菌株的毒力基因型別分布40
• 4.2 不同地區(qū)菌株的毒力基因型別分布40
• 4.3 不同宿主菌株的毒力基因型別分布40-41
• 5 抗菌藥物敏感性檢測41-50
• 5.1 總體情況41-42
• 5.2 不同年份菌株的抗菌藥物敏感情況42-46
• 5.3 不同地區(qū)菌株的抗菌藥物敏感情況46
• 5.4 不同宿主菌株的抗菌藥物敏感情況46-48
• 5.5 不同生物學特性菌株的抗菌藥物敏感情況48-50
• 6 PFGE分型50-56
• 6.1 總體情況50-52
• 6.2 不同年份菌株的PFGE分型情況52
• 6.3 不同地區(qū)菌株的PFGE分型情況52
• 6.4 不同宿主菌株的PFGE分型情況52-53
• 6.5 菌株溯源53-56
• 7 表型分型與PFGE分型間的關聯(lián)56-58
• 8 不同分型方法的分辨能力58-59
• 討論59-69
• 1 動力試驗59
• 2 生物分型59
• 3 血清分型59-61
• 4 毒力基因檢測61
• 5 抗菌藥物敏感性61-64
• 6 PFGE分型64-66
• 7 表型分型與PFGE分型間的關聯(lián)66-68
• 8 不同分型方法的分辨能力68-69
• 結論69-70
• 創(chuàng)新與不足70-71
• 1 創(chuàng)新70
• 2 不足70-71
• 附錄71-80
• 附錄一 實驗中溶液的配置方法71-73
• 附錄二 附表附圖73-80
• 參考文獻80-89
• 致謝89-91
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文91-92
• 學位論文評閱及答辯情況表92

【參考文獻】

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本文編號：895085