本文關鍵詞：空腸彎曲菌感染仔兔模型的建立及動物體內誘導基因的篩選

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【摘要】：空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)是一種重要的食源性人獸共患病原菌。人感染Cj后主要引起細菌性胃腸炎(Bacterial gastroenteritis)和急性腹瀉,免疫力低下者會導致心內膜炎、關節(jié)炎、骨髓炎、腦炎、敗血癥等全身性疾病。但迄今為止,對Cj致病性方面的研究尚不很清楚,其主要原因是缺乏合適的動物模型。本研究嘗試建立空腸彎曲菌感染仔兔腹瀉模型,探索該菌在仔兔模型體內的動態(tài)分布、免疫應答規(guī)律及可能的感染機制；并利用選擇性捕獲轉錄序列方法鑒定了空腸彎曲菌在感染兔體內轉錄的基因,取得了滿意結果。 一、空腸彎曲菌致仔兔腹瀉模型的建立 本研究選用初生仔兔為實驗動物,因為相比嚙齒類動物,兔在系統(tǒng)發(fā)育和生理構造上更相似于人類,初生動物還具有體內清潔、體型小、方便飼養(yǎng)和易于管理等優(yōu)點。根據實驗所得最佳建模條件,使用空腸彎曲菌NCTC11168為攻毒菌株,灌胃1×109CFU劑量感染經西咪替丁(50mg/kg)預處理的2日齡,體重為40+2g的仔兔。通過收集臨床癥狀、病理變化、病原分離和致病性資料評價模型建立情況。結果顯示空腸彎曲菌可人工感染仔兔并引起自限性的、水樣腹瀉癥狀；剖檢發(fā)現主要病變是小腸積液、腸壁出現出血點,盲腸、結腸腫大,腸腔內充滿水樣內容物；組織病理切片顯示盲腸黏膜出現壞死脫落,固有層小血管擴張、充血。病原分離鑒定結果證實各臟器感染菌株均為Cj。劑量反應實驗顯示腹瀉疾病的程度與攻毒劑量、腸道細菌定植量正相關,至少106CFU細菌可引起仔兔可觀察的腹瀉癥狀和各腸道的定植；至少104CFU細菌可引起盲腸和結腸的定植。不同來源空腸彎曲菌分離株對仔兔致病性存在明顯差異,說明該模型能夠有效評價Cj的毒力強弱。 二、空腸彎曲菌仔兔體內感染動態(tài)分析 本研究在建立上述模型的基礎上,分別在攻毒后12,24,36,48和60hr剖檢仔兔,利用細菌分離及PCR方法分析Cj在體內各組織中的分布情況和變化規(guī)律；應用電子顯微鏡技術觀察Cj侵入小腸上皮細胞后引起細胞形態(tài)變化規(guī)律；應用real-time RT-PCR技術檢測Cj感染后仔兔小腸黏膜炎癥趨化因子、細胞因子、抗菌物質和酶類的分泌量變化規(guī)律。研究結果顯示Cj侵入血液的速度很快,對肝臟、腎臟等實質器官的黏附性無明顯差異,并在48hr后被清除；Cj在盲腸和結腸中定植時間大于60hr,定植量高達108CFU/go掃描和透射電子顯微鏡結果顯示Cj可黏附在腸絨毛,并在攻毒后24-36hr侵襲破壞部分上皮細胞；48-60hr可見部分上皮細胞脫落、凋亡,大量上皮內淋巴細胞浸潤。Real-time RT-PCR結果顯示感染后12hr可見IL-10和抗菌肽CAP-18的大量分泌,36hr時IL-18、CCL20分泌增加；60hr時IFN-y、IL-10、IL-8、iNOS發(fā)揮重要免疫作用。 三、選擇性捕獲空腸彎曲菌仔兔體內轉錄序列 本研究以空腸彎曲菌NCTC11168菌株為研究對象,采用選擇性捕獲轉錄序列(Selective capture of transcribed sequences, SCOTS)方法鑒定空腸彎曲菌NCTC11168在感染兔盲腸過程中細菌轉錄的基因序列。經過總RNA分離、cDNAs合成、PCR擴增、SCOTS、陽性克隆測序。結果共獲得9個轉錄序列,按照其編碼蛋白的功能分為4大類：新陳代謝蛋白、細胞表面蛋白、復制相關蛋白和應激相關蛋白。利用real-time RT-PCR對表達基因進行轉錄水平的驗證,結果表明：pnp、katA、cj0609c、cj1481c和acs等5個基因與正常CCDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)的11168菌株的基因轉錄水平相比,在感染兔盲腸組織中轉錄水平上調4.49-116倍,為進一步闡明篩選到的體內表達基因在Cj致病過程中的作用奠定了基礎。
【關鍵詞】：空腸彎曲菌 仔兔模型 組織分布 免疫應答 SCOTS 致病性
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R378.3
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-7
• 目錄7-10
• 符號說明10-11
• 第一章 綜述11-27
• 1 空腸彎曲菌病概述11-13
• 1.1 病原學11-12
• 1.2 流行病學12
• 1.3 臨床癥狀12-13
• 1.4 臨床治療13
• 2 空腸彎曲菌感染動物模型研究進展13-17
• 2.1 靈長類動物13-14
• 2.2 雪貂(Mustela Pulourius Furo)14
• 2.3 仔豬(Piglet)14
• 2.4 兔(Rabbit)14-15
• 2.5 嚙齒類動物15-16
• 2.6 雞16-17
• 2.7 展望17
• 3 細菌體內毒力基因表達技術17-22
• 3.1 差異顯示RT-PCR(DD-RT-PCR)18
• 3.2 差異熒光誘導(DFI)18
• 3.3 DNA芯片技術(DNA chip technique)18-19
• 3.4 代表性差異分析技術(RDA)19
• 3.5 體內表達技術(IVET)19-20
• 3.6 體內誘導抗原技術(IVIAT)20
• 3.7 信號標簽誘變技術(STM)20
• 3.8 抑制消減雜交技術(SSH)20
• 3.9 選擇性抗原捕獲轉錄序列(SCOTS)20-22
• 3.10 展望22
• 參考文獻22-27
• 第二章 空腸彎曲菌致仔兔腹瀉模型的建立27-42
• 1 材料27-28
• 1.1 菌株及實驗動物27
• 1.2 主要試劑27-28
• 1.3 主要儀器28
• 2 方法28-31
• 2.1 菌株復蘇和傳代培養(yǎng)28
• 2.2 攻毒方式28
• 2.3 評價指標28-29
• 2.4 實驗動物Cj感染率分析29
• 2.5 攻毒劑量的確定29
• 2.6 實驗仔兔體重的影響29
• 2.7 感染仔兔模型的建立29-30
• 2.7.1 臨床觀察和樣品的采集29-30
• 2.7.2 感染動物菌株分離與鑒定30
• 2.8 組織病理切片分析30
• 2.9 劑量反應實驗30-31
• 2.10 不同來源空腸彎曲菌分離株對仔兔模型致病性評價31
• 3 結果31-38
• 3.0 實驗動物Cj感染率本底調查31
• 3.1 接種劑量31
• 3.2 仔兔體重31-32
• 3.3 臨床癥狀32
• 3.4 病理變化32-33
• 3.5 各臟器細菌的分離鑒定33-36
• 3.6 劑量反應實驗36-37
• 3.7 不同來源空腸彎曲菌分離株對仔兔模型致病性評價37-38
• 4 討論38-40
• 參考文獻40-42
• 第三章 空腸彎曲菌仔兔體內感染動態(tài)分析42-54
• 1 材料42-43
• 1.1 菌株及實驗動物42
• 1.2 主要試劑42-43
• 1.3 主要儀器43
• 2 方法43-46
• 2.1 動物接種43
• 2.2 樣品采集和處理辦法43
• 2.3 細菌組織分布動態(tài)檢測43-44
• 2.3.1 細菌在實質性器官和血液中消長規(guī)律43
• 2.3.2 細菌在腸道中消長規(guī)律43-44
• 2.4 電子顯微鏡檢測44
• 2.4.1 掃描電子顯微鏡的觀察44
• 2.4.2 透射電子顯微鏡觀察44
• 2.5 感染后腸組織細胞因子分泌動態(tài)變化分析44-46
• 2.5.1 樣品RNA提取44-46
• 2.5.2 熒光定量PCR46
• 3 結果46-50
• 3.1 感染組織中空腸彎曲菌的動態(tài)分布46-48
• 3.2 空腸彎曲菌感染腸道掃描電鏡、透射電鏡觀察48-50
• 3.3 空腸彎曲菌感染宿主天然免疫應答50
• 4 討論50-52
• 參考文獻52-54
• 第四章 選擇性捕獲空腸彎曲菌仔兔體內轉錄序列54-69
• 1 材料54-56
• 1.0 菌株和質粒54
• 1.1 實驗動物和動物試驗54-55
• 1.2 主要試劑55
• 1.3 主要儀器55
• 1.4 引物55-56
• 2 方法56-62
• 2.1 空腸彎曲菌基因組DNA的提取56
• 2.2 空腸彎曲菌rDNA的克隆與鑒定56-58
• 2.3 RNA的分離、cDNA的合成、PCR擴增58-60
• 2.3.1 RNA的提取與純化58-59
• 2.3.2 cDNA第一鏈的合成59
• 2.3.3 cDNA第二鏈的合成59
• 2.3.4 PCR反應59-60
• 2.4 選擇性捕獲轉錄序列60-61
• 2.4.1 基因組DNA的生物素標記和超聲波處理60
• 2.4.2 樣品雜交60-61
• 2.4.3 轉錄序列的捕獲61
• 2.5 SCOTS克隆的PCR鑒定和測序61-62
• 2.6 Real-time RT-PCR驗證差異表達基因62
• 3 結果62-65
• 3.1 細菌基因組DNA的定量62
• 3.2 空腸彎曲菌rDNA的克隆與重組質粒的鑒定62
• 3.3 生物素標記的11168菌株基因組及rDNA重組質粒的破碎62-63
• 3.4 RNA的測定63-64
• 3.5 SCOTS結果64
• 3.6 感染相關基因的功能注釋64
• 3.7 篩選基因的Real-time RT-PCR驗證64-65
• 4 討論65-67
• 參考文獻67-69
• 附錄69-71
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文目錄71-72
• 致謝72-73

【參考文獻】

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本文編號：838983