本文關(guān)鍵詞：基于NASBA技術(shù)檢測細菌耐藥性方法的建立

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【摘要】：目的：產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌在世界各地的爆發(fā)威脅著人類的生命健康，而且攜帶KPC的細菌感染與高死亡率呈正相關(guān)。因此及時準確快速的檢出產(chǎn)KPC細菌對預(yù)防、控制耐藥菌株的流行意義重大。推薦的改良Hodge試驗準確性高，但較費時。PCR擴增檢測時間大大縮短，但對儀器設(shè)備和場所要求較高。核酸序列依賴性擴增NASBA具有操作簡便、擴增效率高、特異性強的優(yōu)點。本研究旨在建立檢測KPC耐藥的NASBA檢測方法，并對該方法進行初步評價。 方法：本實驗采用依賴KPC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的NASBA擴增檢測KPC耐藥。根據(jù)Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、腸桿菌科細菌耐藥基因KPC的保守序列設(shè)計NASBA引物，將上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳及測序鑒定。同時摸索及優(yōu)化NASBA反應(yīng)中各酶濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度等條件，分析該方法的靈敏度和特異性。采用該NASBA方法、PCR及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測臨床收集的45株肺炎克雷伯菌，比較結(jié)果的一致性。 結(jié)果：KPC及MDH的NASBA擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分別得到249nt、190nt的特異性條帶，并且測序鑒定序列與預(yù)計片段序列比對一致。通過摸索及優(yōu)化NASBA反應(yīng)中各酶濃度、離子濃度、反應(yīng)溫度等條件建立NASBA擴增體系（24μl）：緩沖液中氯化鉀終濃度60mmol/L，，氯化鎂終濃度14mmol/L，PH8.0Tris-HCl終濃度40mmol/L，DTT終濃度7.5mmol/L，DMSO終濃度15%；每個引物終濃度0.2μmol/L；dNTP1mmol/L；NTP2mmol/L；酶混合液中T7RNA聚合酶50U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反應(yīng)溫度：40℃；反應(yīng)時間：90min。該NASBA方法能檢測到10-3ng/μl的RNA量，較RT-PCR方法多2個數(shù)量級，提示該方法比RT-PCR靈敏度高；對照KPC陰性菌株與KPC陽性菌株的NASBA擴增產(chǎn)物電泳分析發(fā)現(xiàn)僅KPC陽性菌株出現(xiàn)特異性條帶。45株臨床收集的肺炎克雷伯菌中32株NASBA擴增陽性，13株NASBA擴增陰性，與藥敏、PCR、RT-PCR結(jié)果一致，符合率達到100%。 結(jié)論：NASBA方法檢測KPC型碳青霉烯酶耐藥簡便快速，并且靈敏度和特異性均較高，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：NASBA 耐藥 KPC基因
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378.996
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 引言12-14
• 第一部分 肺炎克雷伯菌 MDH NASBA 擴增方法的建立14-32
• 1 材料14-15
• 1.1 菌株14
• 1.2 主要儀器及耗材14
• 1.3 主要試劑及配制方法14-15
• 1.3.1 主要試劑14-15
• 1.3.2 培養(yǎng)基配制15
• 1.3.3 NASBA 擴增試劑配制15
• 2 方法15-19
• 2.1 NASBA 擴增15-17
• 2.1.1 引物設(shè)計15-16
• 2.1.2 提取細菌 RNA16
• 2.1.3 NASBA 擴增16-17
• 2.2 NASBA 擴增產(chǎn)物的鑒定17
• 2.2.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 NASBA 擴增產(chǎn)物17
• 2.2.2 NASBA 擴增產(chǎn)物核苷酸測序、分析17
• 2.3 NASBA 擴增條件的優(yōu)化17-19
• 2.3.1 NASBA 擴增反應(yīng)溫度的優(yōu)化18
• 2.3.2 NASBA 擴增時間的選擇18
• 2.3.3 NASBA 擴增酶濃度的優(yōu)化18
• 2.3.3.1 NASBA 擴增 T7 RNA 聚合酶最佳反應(yīng)濃度的選擇18
• 2.3.3.2 NASBA 擴增 RNA 酶 H 最佳反應(yīng)濃度的選擇18
• 2.3.3.3 NASBA 擴增 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶最佳反應(yīng)濃度的選擇18
• 2.3.4 NASBA 擴增試劑濃度的優(yōu)化18-19
• 2.3.4.1 NASBA 擴增氯化鉀濃度的優(yōu)化18
• 2.3.4.2 NASBA 擴增氯化鎂濃度的優(yōu)化18-19
• 2.3.4.3 NASBA 擴增 DTT 濃度的優(yōu)化19
• 3 結(jié)果19-29
• 3.1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定 NASBA 擴增產(chǎn)物19-20
• 3.2 NASBA 擴增產(chǎn)物測序、分析20-21
• 3.3 NASBA 擴增反應(yīng)條件的優(yōu)化21-29
• 3.3.1 NASBA 擴增反應(yīng)溫度的篩選21-22
• 3.3.2 NASBA 擴增時間的選擇22-23
• 3.3.3 NASBA 擴增酶濃度的優(yōu)化23-26
• 3.3.4 NASBA 擴增試劑濃度的優(yōu)化26-29
• 4 小結(jié)與討論29-32
• 4.1 初步建立 NASBA 擴增方法29
• 4.2 NASBA 檢測方法的建立29-30
• 4.3 NASBA 反應(yīng)條件對擴增效率的影響30
• 4.4 NASBA 的優(yōu)勢30-32
• 4.4.1 高特異性30-31
• 4.4.2 高靈敏度31
• 4.4.3 高保真度31
• 4.4.4 應(yīng)用前景廣31-32
• 第二部分 肺炎克雷伯菌 KPC 的PCR 檢測及RT-PCR 檢測32-48
• 1 材料32-33
• 1.1 菌株32
• 1.2 主要儀器及耗材32
• 1.3 主要試劑32-33
• 2 方法33-36
• 2.1 藥敏分析判斷標準33
• 2.2 PCR 引物設(shè)計33
• 2.3 培養(yǎng)基的制備33-34
• 2.4 DNA 提取34
• 2.5 PCR 檢測34-35
• 2.5.1 PCR 反應(yīng)體系34-35
• 2.5.2 PCR 反應(yīng)參數(shù)35
• 2.5.3 PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測35
• 2.6 RNA 提取35
• 2.7 RT-PCR 檢測35-36
• 2.7.1 RT-PCR 反應(yīng)體系35-36
• 2.7.2 RT-PCR 反應(yīng)條件36
• 2.7.3 RT-PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測36
• 2.8 特異性檢測36
• 2.9 靈敏度檢測36
• 3 結(jié)果36-47
• 3.1 藥敏分析結(jié)果36
• 3.2 KPC PCR 擴增結(jié)果36-38
• 3.3 KPC RT-PCR 特異性檢測38-39
• 3.4 KPC RT-PCR 靈敏度檢測39-40
• 3.5 KPC RT-PCR 擴增結(jié)果40-47
• 3.5.1 RNA 提取結(jié)果40-42
• 3.5.2 RNA 16s rDNA PCR 結(jié)果42-44
• 3.5.3 cDNA KPC PCR 結(jié)果44-47
• 4 小結(jié)與討論47-48
• 第三部分 肺炎克雷伯菌 KPC NASBA 檢測方法的評價與初步應(yīng)用48-64
• 1 材料48-50
• 1.1 菌株48
• 1.2 主要儀器及耗材48
• 1.3 主要試劑48-49
• 1.4 NASBA 擴增引物設(shè)計49-50
• 2 方法50-51
• 2.1 NASBA 擴增產(chǎn)物核苷酸測序、分析50
• 2.2 MDH 基因靈敏度及特異性實驗50-51
• 2.2.1 MDH 基因靈敏度實驗50
• 2.2.2 MDH 基因特異性實驗50-51
• 2.3 KPC 基因靈敏度及特異性實驗51
• 2.3.1 KPC 基因靈敏度實驗51
• 2.3.2 KPC 基因特異性實驗51
• 2.4 NASBA 方法的臨床初步應(yīng)用51
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析51
• 3 結(jié)果51-62
• 3.1 NASBA 擴增產(chǎn)物核苷酸測序、分析51-52
• 3.2 MDH 基因靈敏度及特異性實驗52-54
• 3.2.1 MDH 基因靈敏度實驗52-53
• 3.2.2 MDH 基因特異性實驗53-54
• 3.3 KPC 基因靈敏度及特異性實驗54-56
• 3.3.1 KPC 基因靈敏度實驗54-55
• 3.3.2 KPC 基因特異性實驗55-56
• 3.4 NASBA 方法的臨床初步應(yīng)用56-62
• 3.4.1 NASBA 擴增結(jié)果56-62
• 4 小結(jié)與討論62-64
• 結(jié)論64-65
• 參考文獻65-68
• 附錄A NASBA 技術(shù)在致病菌檢測中的應(yīng)用68-75
• 參考文獻73-75
• 在學(xué)研究成果75-76
• 致謝76

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