本文關鍵詞：NRAGE對破骨細胞分化的調控作用及機制研究

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【摘要】：骨代謝的穩(wěn)態(tài)由成骨細胞和破骨細胞共同維持的,其中,破骨細胞是骨轉換的啟動者。大多數骨質疏松的發(fā)生與破骨細胞的過渡分化和活性增強相關。破骨細胞調控機制非常復雜,多條信號通路涉及的多種受體、接頭蛋白、轉錄因子等均已被證明可以直接或間接地調控破骨細胞的分化。NRAGE (neurotrophin receptor-interacting MAGE homolog)即黑色素瘤相關抗原,作為細胞內接頭蛋白,已被證明可通過不同的信號通路影響細胞的存活、增殖、凋亡和分化等多種活動。我們前期實驗表明,NRAGE基因敲除可明顯促進破骨細胞的分化,但其機制尚不清楚。鑒于此,本論文從直接作用(RANKL和M-CSF誘導的破骨細胞分化)和間接作用(即成骨細胞對破骨細胞的影響)兩方面探討了NRAGE影響破骨細胞分化的可能調控機制。第一部分：NRAGE對破骨細胞的直接調控作用及機制研究(1)前期實驗表明,NRAGE基因敲除能夠明顯促進RANKL和M-CSF誘導的破骨細胞分化。本論文擴大樣本量(n=6),通過TRAP染色確證了NRAGE對破骨細胞分化的直接調控作用,Q-PCR擴增破骨細胞分化過程中NRAGE的表達也進一步明確了NRAGE對破骨細胞分化的負調控作用。(2)利用Q-PCR,我們分析了在破骨細胞分化過程中,兩個關鍵的轉錄因子c-fos和NFATc1的表達,結果發(fā)現(xiàn),NRAGE敲除后能夠明顯提高c-fos和NFATc1的表達,而且RANKL處理后,NRAGE敲除組提高更為明顯。(3)MAPK(ERK1/2,p38和JNK)是促進破骨細胞分化的經典信號通路,其中p38和JNK信號通路的激活可上調破骨細胞中c-fos和NFATc1的表達。同時,在細胞凋亡的研究中,NRAGE被證明參與ERK1/2, p38和JNK信號通路的調節(jié)。鑒于此,我們分離了敲除組和野生組骨髓單核細胞,用RANKL和M-CSF處理不同的時間段(0,5,15和30分鐘),收集蛋白,Western blot分析ERK1/2,p38和JNK的磷酸化水平,結果發(fā)現(xiàn)：NRAGE敲除組ERK1/2, p38和JNK的磷酸化水平并沒有明顯提高,提示NRAGE敲除對破骨細胞分化的直接促進作用并不是通過MAPK(ERK1/2, p38和JNK)通路而實驗的。NRAGE敲除后對c-fos和NFATc1的表達的上調和破骨細胞的分化促進作用可能是通過NF-κB(前期已經證明,見許麗娟論文),亦或其他尚未檢測的信號通路來實現(xiàn)。第二部分：NRAGE對破骨細胞的間接調控作用及機制研究前期實驗表明,NRAGE可促進成骨細胞的分化和活性,活性提高的成骨細胞進而促進破骨細胞分化,但是機制并不清楚。為此,本論文分離純化了敲除組和對照組新生鼠顱骨細胞,并進行了成骨分化誘導(抗壞血酸,終濃度50μg/mL+β-甘油磷酸鈉,終濃度10mM),將誘導分化7天的成骨細胞和未誘導分化的成骨細胞進行了基因表達譜分析,經Q-PCR驗證表明,該基因芯片可靠性較好。利用FatiGO數據庫對差異表達基因的分子功能和生物功能分析,并結合文獻查閱,發(fā)現(xiàn)NRAGE基因敲除組與野生組比較,在可能與骨發(fā)育或骨代謝相關的基因中,2倍上調基因43個,2倍下調基因41個。采用Biocarta數據庫,對差異表達基因信號通路分析表明,差異表達基因主要集中在炎癥、細胞因子和趨化因子以及Wnt等信號通路上。根據基因芯片的提示,我們從Wnt信號通路、炎性因子,以及經典的RANKL/OPG的比率等方面,分析了NRAGE敲除后成骨細胞對破骨細胞分化影響的可能機制。結果發(fā)現(xiàn)：(1)Wnt5a刺激后,NRAGE敲除組和野生組破骨細胞分化并沒有明顯改變,提示Wnt5a介導的信號通路沒有參與NRAGE敲除后的破骨分化增強過程。(2)Q-PCR擴增不同分化階段的成骨細胞(敲除組和野生組)中炎性因子(Ccl2、Cox-2、 Cxcl1、Cxcl5、IL-6、KC)的表達,結果發(fā)現(xiàn)大部分炎癥因子在敲除組中的表達都高于野生組,尤其在成骨分化前期(day0和day7),炎性因子提高程度更為明顯,提示：NRAGE敲除后可能增強了成骨細胞炎性因子的合成,從而進一步促進了破骨細胞的分化。(3) RANKL/OPG比率是判斷成骨細胞對破骨細胞分化影響的一個重要指標。Q-PCR和Western blot結果顯示,NRAGE敲除后,OPG在成骨分化整個過程中表達明顯下調,而RANKL在成骨分化早期(day0)和后期(day28)表達上調,在day7和dayl4表達沒有明顯改變。其RANKL/OPG比率在NRAGE基因敲除小鼠成骨細胞整個分化過程中明顯上調,這可能是NRAGE基因敲除小鼠成骨細胞促進破骨細胞分化的一個重要機制之一。主要結論：1. NRAGE基因敲除可直接促進破骨細胞分化,影響破骨細胞分化的關鍵轉錄因子c-fos和NFAT1明顯上調,但破骨細胞的分化增強和c-fos、NFATcl的上調作用并不是通過MAPK(ERKl/2, p38和JNK)來實現(xiàn)。2. NRAGE敲除后,其成骨細胞可間接促進破骨細胞分化,成骨細胞炎性因子合成的增強和RANKL/OPG比率的提高可能成骨細胞對破骨細胞影響的重要機制。
【關鍵詞】：NRAGE 敲除小鼠 破骨細胞分化 成骨細胞 基因芯片
【學位授予單位】：南京師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 英文縮寫詞表4-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-13
• 前言13-24
• 第一部分 NRAGE對破骨細胞分化和骨吸收功能的直接調控作用及機制研究24-44
• 1. 材料24-27
• 2. 實驗方法27-36
• 3. 實驗結果36-41
• 4. 討論41-44
• 第二部分 NRAGE對破骨細胞分化和骨吸收功能的間接調控作用及機制研究44-72
• 1. 材料44-47
• 2. 實驗方法47-53
• 3. 實驗結果53-69
• 4. 討論69-72
• 全文總結72-73
• 附錄一73-75
• 附錄二75-96
• 研究生期間發(fā)表的文章96-97
• 致謝97-99
• 參考文獻99-102

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本文編號：814394