本文關(guān)鍵詞：微生物來(lái)源結(jié)核分枝桿菌蛋白激酶B抑制劑篩選模型的建立和應(yīng)用

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【摘要】：肺結(jié)核(TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis, Mtb)引起的一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性傳染病,世衛(wèi)組織《2013年全球結(jié)核病報(bào)告》中表明2012年結(jié)核病病人數(shù)為860萬(wàn)人,全球結(jié)核病死亡數(shù)130萬(wàn),盡管感染人數(shù)和死亡人數(shù)均呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì),但仍面臨著結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生耐藥性的危機(jī)。同時(shí),抗結(jié)核藥物研發(fā)進(jìn)展的緩慢更加劇了結(jié)核防治任務(wù)的艱巨性。因此,開(kāi)發(fā)針對(duì)新穎靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物已經(jīng)迫在眉睫。 結(jié)核分枝桿菌中存在11種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknA-PknL (STPKs)[1],其中PknB廣泛參與到了有關(guān)結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)繁殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,在結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)分裂和細(xì)胞形態(tài)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用,為結(jié)核分枝桿菌生存所必需,可作為抗結(jié)核藥物的篩選靶點(diǎn)之一 本研究表達(dá)純化了PknB的N端激酶結(jié)構(gòu)域蛋白,并以其為靶標(biāo)建立并優(yōu)化了適用于微生物發(fā)酵液樣品篩選的、以NADH比色法為基礎(chǔ)的PknB抑制劑高通量篩選模型,此模型與本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的以螢光素酶法為基礎(chǔ)的PknB抑制劑篩選模型相比,最大的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)體系在最后的結(jié)果檢測(cè)中不受樣品顏色的干擾,可用于篩選顏色較深的發(fā)酵液樣品。 本研究利用該模型篩選了20000個(gè)發(fā)酵液樣品,得到陽(yáng)性發(fā)酵液樣品56個(gè),其中5株陽(yáng)性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的發(fā)酵液樣品對(duì)結(jié)核分枝桿菌PknB酶活和恥垢分枝桿菌、海分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用。其中,陽(yáng)性樣品I10AA-00359、I11AA-01925和I11AA-02296具有較低的細(xì)胞毒性。 本研究為考察這五個(gè)陽(yáng)性樣品的酶活抑制選擇性,表達(dá)了結(jié)核分枝桿菌PknH、PknF和人的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT-1,分別建立和優(yōu)化了各蛋白的酶活測(cè)定方法。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室原有的工作,初步建立了結(jié)核分枝桿菌絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶酶活抑制特異性的評(píng)價(jià)體系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品I10AA-00359、I10AA-00827, I11AA-02040和I11AA-02296的酶活抑制選擇性較好。 最后,本研究對(duì)5個(gè)陽(yáng)性發(fā)酵液樣品進(jìn)行了初步的分離,并對(duì)分離后各部份進(jìn)行了抑酶、抗菌活性的測(cè)定和細(xì)胞毒性及酶活抑制選擇性的評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示,I11A-02040菌株發(fā)酵液上清和菌絲體甲醇抽提后正丁醇萃取部份(D、H)以及I10A-00827菌株發(fā)酵液上清正丁醇萃取部份(D)具有良好的抑酶、抗菌活性,并具有較小的細(xì)胞毒性和較好的酶活抑制選擇性,為后續(xù)活性物質(zhì)的分離純化奠定了初步的基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 PknB 微生物發(fā)酵液 抑制劑
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-8
• 中文摘要8-9
• Abstract9-10
• 前言10-12
• 實(shí)驗(yàn)材料12-21
• 實(shí)驗(yàn)方法21-45
• 一、基于NADH比色法以PknB為靶點(diǎn)的高通量篩選模型的建立和優(yōu)化21-31
• 1 重組質(zhì)粒pET28a-pknB-N、pET30a-garA在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)21-25
• 2 目的蛋白的純化25-27
• 3 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白PknB-N酶活性檢測(cè)方法的建立27-28
• 4 結(jié)核分枝桿菌重組蛋白PknB-N酶活測(cè)定體系的優(yōu)化28-30
• 5 待測(cè)樣品對(duì)PknB-N抑制作用的測(cè)定30-31
• 6 假陽(yáng)性結(jié)果的排除31
• 二、結(jié)核分枝桿菌PknB抑制劑細(xì)胞水平的性質(zhì)評(píng)價(jià)31-33
• 1 微稀釋法檢測(cè)酶水平陽(yáng)性樣品的抗菌活性31-32
• 2 MTT比色法檢測(cè)陽(yáng)性發(fā)酵液樣品對(duì)細(xì)胞存活的影響32-33
• 三、陽(yáng)性發(fā)酵液樣品體外酶活抑制選擇性評(píng)價(jià)體系的建立及應(yīng)用33-43
• 1 陽(yáng)性發(fā)酵液樣品對(duì)結(jié)核分枝桿菌肽脫甲酰基酶(PDF)酶活抑制性評(píng)價(jià)33-34
• 2 結(jié)核分枝桿菌蛋白激酶H、蛋白激酶F、人蛋白激酶AKT-1的誘導(dǎo)表達(dá)34-40
• 3 基于NADH比色法的結(jié)核分枝桿菌重組蛋白PknH、PknF和人的重組蛋白AKT-1酶活性檢測(cè)方法的建立40-43
• 四、陽(yáng)性菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的初步處理及活性測(cè)定43-45
• 1 五株陽(yáng)性菌株I10A-00359、I10A-00827、I11A-01925、I11A-02040、I11A-02296的發(fā)酵43
• 2 五株陽(yáng)性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的初步處理43-45
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論45-71
• 一、基于NADH比色法以PknB為靶點(diǎn)的高通量篩選模型的建立和優(yōu)化45-52
• 1 結(jié)核分枝桿菌重組PknB-N、GarA的表達(dá)與純化45-46
• 2 結(jié)核分枝桿菌重組PknB-N酶活性檢測(cè)體系的優(yōu)化46-51
• 3 發(fā)酵液樣品酶水平的篩選51-52
• 二、復(fù)篩陽(yáng)性發(fā)酵液樣品細(xì)胞水平的活性和毒性評(píng)價(jià)52-53
• 1 復(fù)篩陽(yáng)性發(fā)酵液樣品的處理52
• 2 復(fù)篩陽(yáng)性發(fā)酵液樣品抗菌活性評(píng)價(jià)52-53
• 3 復(fù)篩陽(yáng)性發(fā)酵液樣品細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)53
• 三、陽(yáng)性發(fā)酵液樣品體外酶活抑制選擇性評(píng)價(jià)體系的建立53-66
• 1 pET28a-pknH、pET28a-pknF、pET28a-akt-1質(zhì)粒的構(gòu)建53-55
• 2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)及目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)后可溶性評(píng)價(jià)55-56
• 3 目的蛋白的純化56-57
• 4 基于NADH比色法PknH、PknF、AKT-1蛋白酶活測(cè)定體系的建立57-65
• 5 復(fù)篩陽(yáng)性發(fā)酵液樣品的酶活抑制選擇性評(píng)價(jià)65-66
• 四、復(fù)篩陽(yáng)性菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的初步處理及活性測(cè)定66-71
• 1 五株陽(yáng)性菌株發(fā)酵產(chǎn)物的初步處理66
• 2 五株陽(yáng)性菌株發(fā)酵產(chǎn)物初分后各部份的活性測(cè)定及結(jié)果分析66-71
• 小結(jié)71-72
• 參考文獻(xiàn)72-75
• 文獻(xiàn)綜述75-85
• 參考文獻(xiàn)82-85
• 致謝85

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 高鵬;肖春玲;姜威;蔣建東;;Ser/Thr蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)——抗結(jié)核藥物篩選的新靶點(diǎn)[J];國(guó)外醫(yī)藥(抗生素分冊(cè));2007年02期

2 唐先兵,司書毅,張?jiān)虑?腸球菌肽脫甲�；冈诖竽c桿菌BL21(DE3)中高效表達(dá)及其活性檢測(cè)[J];中國(guó)生物工程雜志;2004年03期

3 張麗蓉;趙莉莉;魏玉珍;李秋萍;王莉?qū)?余利巖;;以肽脫甲酰基酶為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物高通量篩選模型的建立和應(yīng)用[J];中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù);2012年02期

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本文編號(hào)：798034