本文關(guān)鍵詞：小鼠胸腺及其對(duì)異種抗原細(xì)胞的應(yīng)答

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【摘要】：研究背景與目的 胸腺是哺乳動(dòng)物的中樞免疫器官,是T細(xì)胞分化發(fā)育和成熟的場(chǎng)所,胸腺為T細(xì)胞發(fā)育提供了一個(gè)縝密而復(fù)雜的微環(huán)境,有序的調(diào)控T細(xì)胞的發(fā)育成熟和遷移。胸腺基質(zhì)細(xì)胞、可溶性分子以及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成T細(xì)胞發(fā)育的胸腺微環(huán)境。胸腺基質(zhì)細(xì)胞間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),不僅起網(wǎng)狀支架作用,而且由于這些細(xì)胞表面攜帶大量表面分子、并可以分泌多種胸腺激素和細(xì)胞因子,從而為胸腺細(xì)胞的發(fā)育和成熟提供合適的微環(huán)境。T細(xì)胞在胸腺內(nèi)經(jīng)歷TCR重排,陽性選擇和陰性選擇等發(fā)育過程最終發(fā)育為成熟的T淋巴細(xì)胞并遷移到外周免疫器官。 根據(jù)傳統(tǒng)的誘導(dǎo)性中樞耐受的理論機(jī)制,如果T細(xì)胞發(fā)育過程中在胸腺內(nèi)接觸到異基因的抗原,則會(huì)被誘導(dǎo)出對(duì)該異基因外周移植物的耐受,同時(shí),血-胸腺屏障使血液中的大分子物質(zhì)包括外來抗原不能進(jìn)入胸腺,所以胸腺內(nèi)注射異基因抗原可以躲過免疫監(jiān)視,誘導(dǎo)出對(duì)異基因抗原耐受的T細(xì)胞。為了探索異種抗原細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)特性及機(jī)體產(chǎn)生的免疫耐受和免疫排斥情況,我們將作為異種不同組織的、MHC差異較大的抗原人肝癌細(xì)胞Hep-G2注射到10-15d的C57BL/6小鼠的胸腺中,動(dòng)態(tài)觀察小鼠胸腺對(duì)其發(fā)生的應(yīng)答,進(jìn)而了解抗原在小鼠胸腺微環(huán)境中對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響及胸腺內(nèi)可能發(fā)生的免疫應(yīng)答機(jī)制和外源人肝癌細(xì)胞對(duì)胸腺微環(huán)境及T細(xì)胞發(fā)育分化的影響,以及異種人肝癌細(xì)胞在小鼠胸腺內(nèi)的命運(yùn)。 研究方法 1.小鼠胸腺內(nèi)注射及注射對(duì)小鼠胸腺造成的組織病理變化分析 1)小鼠胸腺發(fā)育情況分析； 2)細(xì)胞培養(yǎng)與DiI標(biāo)記； 3)胸腺內(nèi)注射方法的簡(jiǎn)化； 4)注射效率的評(píng)估：解剖學(xué)觀察判斷及FCM分析檢測(cè)注射效率 5)注射后小鼠體重變化分析與注射方法對(duì)小鼠的損傷評(píng)估； 6)石蠟切片制作與HE染色觀察； 2.小鼠胸腺對(duì)異種抗原細(xì)胞的應(yīng)答 1)人肝癌細(xì)胞培養(yǎng)與DiI標(biāo)記； 2)小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞； 3)小鼠胸腺組織稱重及胸腺細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)； 4)石蠟切片制作與HE染色觀察胸腺組織病理變化； 5)FCM分析胸腺內(nèi)各類細(xì)胞亞群比例的變化(T細(xì)胞、NK/NKT細(xì)胞及調(diào)節(jié)性細(xì)胞)； 6)FCM分析胸腺細(xì)胞凋亡情況； 研究結(jié)果 第一部分： 小鼠胸腺發(fā)育情況分析 小鼠在青春期前快速生長(zhǎng)和發(fā)育,到青春期時(shí)達(dá)到一個(gè)頂峰,在此之后便開始萎縮；小鼠胸腺的體積也隨年齡增長(zhǎng)而變化。 Dil染色標(biāo)記觀察 Hep-G2人肝癌細(xì)胞在含有20ug/ml DiI的基本培養(yǎng)基中標(biāo)記30min后,細(xì)胞標(biāo)記成功,并發(fā)射出強(qiáng)烈的紅色熒光。 注射效率評(píng)估 通過解剖學(xué)觀察,成鼠組的注射成功率為81.47%,乳鼠組的注射成功率為76%,FCM分析的結(jié)果證實(shí)此種注射方法基本能夠保證注射的準(zhǔn)確性。 注射方法對(duì)小鼠損傷程度的評(píng)估 通過對(duì)注射后小鼠行為及體重的變化分析,我們發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠在體重和行為上均未表現(xiàn)出明顯變化,由此我們認(rèn)為此注射方法對(duì)小鼠的損傷程度很小,值得應(yīng)用和推廣。 石蠟切片HE染色觀察結(jié)果 Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)遭遇到淋巴細(xì)胞的攻擊與殺傷,注射后3d就檢測(cè)到淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)及巨噬細(xì)胞的募集；注射后7d,大部分的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)死亡,腫瘤細(xì)胞周圍密集大量的淋巴細(xì)胞；注射后14d,已經(jīng)檢測(cè)不到存活的腫瘤細(xì)胞,腫瘤細(xì)胞形態(tài)模糊,周圍大量淋巴細(xì)胞密集；注射后21d和28d,已經(jīng)檢測(cè)不到腫瘤細(xì)胞的存在。 第二部分： 胸腺重量及胸腺細(xì)胞總數(shù)變化 相比于平行對(duì)照組,胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞后7d,14d及21d實(shí)驗(yàn)組小鼠的胸腺重量明顯增加,而此時(shí)的胸腺細(xì)胞總數(shù)卻明顯減少。 小鼠胸腺組織有一定損傷 注射后3d檢測(cè)到注入人肝癌細(xì)胞的胸腺組織區(qū)域有機(jī)械損傷的跡象,有的能明顯看出是注射針在胸腺內(nèi)入針時(shí)造成的機(jī)械損傷,有些則為細(xì)胞懸液及注射針推力共同作用的結(jié)果。 小鼠胸腺組織皮質(zhì)與髓質(zhì)比例變化 胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞后3d,檢測(cè)到胸腺內(nèi)腫瘤細(xì)胞密集的區(qū)域?yàn)榇竺娣e的髓質(zhì)區(qū),而注射后14d的結(jié)果顯示髓質(zhì)區(qū)明顯增加,而皮質(zhì)區(qū)卻很少。 胸腺上皮細(xì)胞變化 小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞后,梭形上皮細(xì)胞聚集并環(huán)繞在腫瘤細(xì)胞周圍,注射后16d上皮細(xì)胞非常密集并環(huán)繞腫瘤細(xì)胞殘骸形成橢圓形結(jié)構(gòu),注射后21d和28d數(shù)層鱗狀上皮細(xì)胞環(huán)繞圍成同心圓結(jié)構(gòu)包繞腫瘤細(xì)胞殘骸,注射后2個(gè)月胸腺組織恢復(fù)正常。胸腺內(nèi)注射后,在小鼠胸腺組織空隙的地方檢測(cè)到上皮細(xì)胞的富集,提示上皮細(xì)胞參與了胸腺組織的重建過程。 FCM檢測(cè)胸腺內(nèi)各類細(xì)胞亞群變化 與對(duì)照組小鼠相比,注射Hep-G2后1周的小鼠胸腺內(nèi)CD4CD8雙陽性細(xì)胞比例明顯減少,CD4CD8雙陰性細(xì)胞、CD4/CD8單陽性細(xì)胞及NKT細(xì)胞的比例有明顯升高現(xiàn)象；注射后2周檢測(cè)到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例也有增高的現(xiàn)象；注射后3周胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞、NK/NKT細(xì)胞的比例未見有明顯變化； 胸腺細(xì)胞凋亡檢測(cè) 胸腺內(nèi)注射Hep-G2后1周,實(shí)驗(yàn)組小鼠胸腺細(xì)胞的凋亡率有明顯升高現(xiàn)象,注射后3周凋亡率沒有明顯變化。 研究結(jié)論 1.通過對(duì)小鼠胸腺內(nèi)注射方法進(jìn)行簡(jiǎn)化,我們構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單的小鼠胸腺內(nèi)注射的方法用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究。 2.明確了異種人肝癌細(xì)胞Hep-G2在小鼠胸腺內(nèi)被免疫細(xì)胞攻擊與清除的命運(yùn),并初步確定巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞及成熟的T淋巴細(xì)胞均參與了Hep-G2細(xì)胞的免疫攻擊與清除。 3. Hep-G2的注入,對(duì)小鼠胸腺組織造成一定的病理損傷,包括注射造成的胸腺組織機(jī)械損傷、皮質(zhì)與髓質(zhì)比例的失衡、胸腺細(xì)胞總數(shù)的減少及上皮細(xì)胞的嚴(yán)重增生等,但隨著外來腫瘤細(xì)胞的免疫清除,這些組織病理學(xué)變化也逐漸消失,小鼠胸腺組織恢復(fù)正常。 4.人肝癌細(xì)胞的人為注入,對(duì)小鼠胸腺內(nèi)T細(xì)胞發(fā)育及各類細(xì)胞亞群比例均造成一定影響,胸腺細(xì)胞凋亡比例升高,CD4CD8雙陽性細(xì)胞比例顯著減小,同時(shí),CD4/CD8單陽性細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及NK/NKT細(xì)胞的比例有所上升,但隨著外來腫瘤細(xì)胞的免疫清除,各類細(xì)胞亞群比例又恢復(fù)正常。
【關(guān)鍵詞】：胸腺內(nèi)注射 異種抗原 胸腺微環(huán)境 免疫耐受 MHC限制
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• Abstract10-15
• 符號(hào)說明15-16
• 前言16-25
• 第一部分 小鼠胸腺內(nèi)注射及注射對(duì)小鼠胸腺造成的組織病理變化分析25-42
• 1. 前言25-26
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備26-29
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.2 主要試劑與其配置27-28
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器28-29
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 3.1 小鼠胸腺發(fā)育情況分析29-30
• 3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與DⅡ標(biāo)記30-31
• 3.3 小鼠胸腺內(nèi)注射方法的簡(jiǎn)化31-32
• 3.4 注射效率評(píng)估32-33
• 3.5 小鼠損傷程度的評(píng)估33
• 3.6 組織學(xué)分析33-35
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-40
• 5. 討論40-42
• 第二部分 小鼠胸腺對(duì)異種抗原細(xì)胞的應(yīng)答42-59
• 1. 前言42-43
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備43-45
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料43
• 2.2 主要試劑及其配制43-44
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器44-45
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法45-47
• 3.1 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與DⅡ標(biāo)記45
• 3.2 小鼠胸腺內(nèi)注射人肝癌細(xì)胞45
• 3.3 小鼠胸腺組織稱重及胸腺細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)45-46
• 3.4 組織病理學(xué)分析46
• 3.5 FCM分析胸腺內(nèi)各類細(xì)胞亞群比例變化46-47
• 4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-57
• 5. 討論57-59
• 論文總結(jié)與展望59-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 致謝67-68
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 韓鵬;張大慶;;胸腺功能的發(fā)現(xiàn)及其對(duì)免疫學(xué)發(fā)展的影響[J];醫(yī)學(xué)與哲學(xué);2005年13期

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本文編號(hào)：795459