本文關(guān)鍵詞：人賴氨酸特異性去甲基化酶LSD1小分子抑制劑的發(fā)現(xiàn)

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【摘要】：人賴氨酸特異性去甲基化酶(Human lysine specific demethylasel, LSD1)是胺氧化酶家族成員,在黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin adenine dinucleotide, FAD)的參與下,LSDl可以特異去除組蛋白H3上第四位(H3K4)和第九位(H3K9)賴氨酸殘基上的二甲基和一甲基修飾。LSD1還能去除其它一些非組蛋白底物上的甲基化修飾,例如p53和DNMT1等。LSD1具有多種生物學(xué)功能,主要包括促進(jìn)腫瘤增殖、抑制能量代謝、促進(jìn)脂肪合成、抑制脂解和調(diào)控細(xì)胞分化等。2014年,EMA批準(zhǔn)第一個(gè)LSD1特異型抑制劑ORY-1001進(jìn)行一期臨床試驗(yàn),用于治療急性髓系白血病。因此,LSD1成為潛在的藥物作用靶標(biāo)。 我們從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)并純化得到了GST融合表達(dá)的LSD1重組蛋白,利用Perkin Elmer公司的Lance試劑盒成功建立并優(yōu)化了LSDl活性檢測(cè)方法,建立了LSD1的高通量篩選(High throughput screening, HTS)模型。并對(duì)國(guó)家化合物樣品庫(kù)和國(guó)家新藥篩選中心化合物庫(kù)中的337563個(gè)樣品進(jìn)行篩選,得到284個(gè)抑制活性較好的化合物。其中37個(gè)樣品ICso低于0.5μg/mL,抑制活性最好的化合物為WNN0649-F005,其抑制LSD1的IC50為0.012μg/mL,與進(jìn)入臨床一期的化合物ORY-1001抑制IC50相當(dāng)。 我們進(jìn)一步利用MTS方法檢測(cè)了部分化合物對(duì)THP-1、HL-60和RPMI8226三株腫瘤細(xì)胞株增殖抑制的情況和對(duì)胺氧化酶MAOA的選擇性抑制活性,最終發(fā)現(xiàn)化合物WNN0649-F005和WNN0819-F004對(duì)這三株細(xì)胞具有較好的增殖抑制活性,同時(shí)部分LSD1化合物同樣具有對(duì)MAOA抑制活性。 綜上所述,我們通過建立LSD1的高通量篩選模型,篩選獲得一批對(duì)LSD1活性抑制較好的化合物,并通過MTS方法驗(yàn)證了化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果。為進(jìn)一步的化合物結(jié)構(gòu)改造和抗腫瘤的藥物發(fā)現(xiàn)打下了基礎(chǔ),具有重要的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：LSD1 高通量篩選 腫瘤 抑制劑 非組蛋白底物
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R3411
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-11
• 第一章 緒論11-27
• 1.1 表觀遺傳學(xué)11-13
• 1.2 組蛋白的甲基化修飾13-14
• 1.3 LSD1的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)介及生物學(xué)功能14-27
• 1.3.1 LSD1的分子結(jié)構(gòu)14-16
• 1.3.2 LSD1非組蛋白底物16-17
• 1.3.3 LSD1的組織分布17-18
• 1.3.4 LSD1的生物學(xué)功能18-23
• 1.3.5 LSDl現(xiàn)有抑制劑23-27
• 第二章 LSD1活性蛋白的表達(dá)及純化27-43
• 2.1 材料27-29
• 2.2 試驗(yàn)方法29-35
• 2.2.1 常規(guī)分子生物學(xué)方法29
• 2.2.2 引物的設(shè)計(jì)以及合成29
• 2.2.3 目的基因的擴(kuò)增29-30
• 2.2.4 限制性內(nèi)切酶酶切30
• 2.2.5 連接與轉(zhuǎn)化30-31
• 2.2.6 質(zhì)粒抽提與驗(yàn)證31
• 2.2.7 重組蛋白表達(dá)條件的摸索31-32
• 2.2.8 重組目的蛋白的純化32-33
• 2.2.9 蛋白濃度測(cè)定33
• 2.2.10 目的蛋白活性的檢測(cè)33-34
• 2.2.11 最適反應(yīng)酶濃度34
• 2.2.12 最適反應(yīng)時(shí)間34-35
• 2.2.13 陽(yáng)性化合物確認(rèn)35
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-41
• 2.4 討論41-43
• 第三章 LSD1抑制劑的高通量篩選43-57
• 3.1 材料43-44
• 3.2 方法44-50
• 3.2.1 高通量篩選反應(yīng)體系的確定44-45
• 3.2.2 高通量篩選前的質(zhì)量控制45-46
• 3.2.3 高通量篩選46-50
• 3.3 結(jié)果50-55
• 3.3.1 篩選系統(tǒng)的穩(wěn)定性和可信度50-51
• 3.3.2 高通量篩選結(jié)果51-55
• 3.4 討論55-57
• 第四章 LSD1抑制劑細(xì)胞水平評(píng)價(jià)和選擇性評(píng)價(jià)57-68
• 4.1 材料57-58
• 4.2 方法58-60
• 4.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)58
• 4.2.2 MTS法檢測(cè)細(xì)胞活性58-59
• 4.2.3 MAOA檢測(cè)原理59
• 4.2.4 MAOA最適反應(yīng)濃度的確定59-60
• 4.2.5 MAOA最適反應(yīng)時(shí)間60
• 4.2.6 MAOA最適底物濃度60
• 4.2.7 陽(yáng)性化合物確認(rèn)60
• 4.2.8 候選化合物對(duì)MAOA活性的影響60
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-66
• 4.4 實(shí)驗(yàn)討論66-68
• 結(jié)論68-70
• 參考文獻(xiàn)70-76
• 碩士期間取得的科研成果76-77
• 致謝77-78

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本文編號(hào)：774454