本文關鍵詞：銅綠假單胞菌PAO1 lasI、rhlI基因缺失菌株的構建及其對接合的影響

  更多相關文章： 銅綠假單胞菌 群體感應系統(tǒng) 同源重組 高絲氨酸內酯 自殺性質粒 接合反應

【摘要】：目的： 細菌與細菌之間存在交流,許多種類的細菌可以根據特定信號分子的濃度來監(jiān)測周圍環(huán)境中自身或其它細菌的數量變化,當環(huán)境中信號分子達到一定濃度閾值時,信號分子進入細胞內與胞內受體結合啟動相關基因的表達來適應環(huán)境的變化,這一調節(jié)體系即為細菌群體感應系統(tǒng)(Quorum Sensing System, QS)或密度感應系統(tǒng),也稱自誘導(autoincer, AIs)[1]。 在銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)中,至少存在兩套基于AHLs(Acyl-homoserine lactone,或HSL,即高絲氨酸內酯)調節(jié)的QS系統(tǒng)：一種是控制細胞外毒力因子表達的1as系統(tǒng),另一種是控制幾種二級代謝所需產物的rhl系統(tǒng)。las系統(tǒng)由LasR和Lasl組成,rhl系統(tǒng)則由RhlR和RhlI組成。LasR和RhlR為信號分子受體,而LasI和RhlI則分別是HSL信號分子N-3-oxododecanoyl-L-homoserinelactone(3-oxo-C12-HSL或OdDHL)和N-butanoyl-L-homoserinelaetone(C4-HSL,或BHL)的合成酶,分別由lasI和rhlI基因編碼合成。QS系統(tǒng)中,存在著一定的級聯關系,有研究表明las系統(tǒng)在這種級聯關系中處于最高層,可以激活另外一些調節(jié)器的轉錄表達,如RhlR/RhlI;在QS這個調控的關系網中,Las系統(tǒng)的作用是最主要的,它能調控Rhl,使3-oxo-C12-HSL的分泌不受C4-HSL的影響。 PA是一種臨床常見的革蘭陰性條件致病菌,隨著抗生素的廣泛應用和不合理使用,使得PA對抗生素的耐藥程度日趨嚴重,泛耐、全耐的PA層出不窮,給臨床PA感染的治療帶來了極大的困難,PA的耐藥主要由兩種機制引起：一是染色體上結構基因發(fā)生點突變、插入或缺失,引起編碼的蛋白質氨基酸序列發(fā)生改變,導致對抗菌藥物的敏感性降低或喪失,如外膜孔蛋白OprD2缺失、青霉素結合蛋白靶位改變等；二是通過細菌間耐藥基因水平轉移(horizontal gene transfer, HGT)獲得耐藥基因。耐藥基因水平轉移方式有轉導、轉化和接合,而接合(conjugation)是耐藥基因水平轉移的一個主要方式,調節(jié)接合轉移的機制很多,但目前尚不十分清楚。有研究表明,�；呓z氨酸內酯(acylated homoserine lactones, HSL)在根癌土壤桿菌Ti質粒的接合轉移中起重要作用,但在PA耐藥基因水平轉移中是否發(fā)揮作用尚未見報道。 為給研究HSL在銅綠假單胞菌中接合反應中的作用奠定更好的基礎,本實驗分別對PA01菌株lasI、rhlI基因進行單、雙突變,構建突變菌株,并在此基礎上研究HSL對接合反應頻率的影響。 方法： 1.構建PA01lasI、rhlI基因分別單、雙缺失突變的菌株采用同源重組的方式,首先通過PCR擴增lasI、rhlI的上下游片段,分別插入pMDl8、pUCl9,然后在此基礎上插入正向篩選標記慶大霉素耐藥基因(GM)、反向篩選標記蔗糖敏感基因(sacB)以及接合轉移基因(mob),構建帶有同源片段的自殺性質粒pGSM-△lasI和pGSM-△rhlI。通過接合轉移的方式將質粒pGSM-△lasI轉入PA01可獲得lasI單突變菌株,將質粒pGSM-△rhlI轉入PA01可獲得rhlI單突變菌株,再將pGSM-△lasI轉入rhlI單突變菌株中則可獲得雙突變菌株。 2.突變菌株的鑒定首先,設計lasI、rhlI基因的外引物,通過PCR對同源重組的菌株初篩并測序確定；其次,合成生物素標記的探針,采用southern blot對lasI基因單突變的菌株實行進一步確證；再次,建立高效液相色譜串聯質譜(HPLC/MS)檢測HSL的方法,從基因表達方面來驗證lasI、rhlI基因缺失后HSL信號分子分泌情況。 3.建立E.coli-PA接合反應模型,研究HSL對接合反應頻率的影響采用濾膜雜交法,E.coliSM10λ pir(pUCP24T)分別與PA01,PA-△lasI、 PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI進行接合反應,通過平板菌落計數法計算接合反應頻率。 結果： 1.構建自殺性質粒pGSM-△lasI,pGSM-△rhlI,lasI基因缺失菌株PA-△lasI,rhlI基因缺失菌株PA-△rhlI,以及l(fā)asI、rhlI雙缺失菌株PA-△lasIrhlI。并通過PCR及基因測序、Southern blot證實突變菌株構建成功。 2.通過HPLC/MS檢測HSL,PA-△lasI菌株中未檢測到3-oxo-C12-HSL且C4-HSL也低于檢測限；PA-△rhlI菌株中檢測到3-oxo-C12-HSL正常產生且與PA01比較無差異(P0.05),但C4-HSL檢測不到；PA-△lasIrhlI菌株中3-oxo-C12-HSL與C4-HSL均檢測不到。3-oxo-C12-HSL在與C4-HSL在6h時開始檢測到,且隨著時間增加,C4-HSL的量逐漸增加,而3-oxo-C12-HSL則基本保持穩(wěn)定。加入2u g/mL阿奇霉素(AZM)后,3-oxo-C12-HSL與PA01組相較明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),C4-HSL量有減少趨勢但與PA01比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.在E.coli-PA接合反應中,PA-△lasI、PA-△rhlI、PA-△lasIrhlI的接合反應頻率較PA01組降低(P0.05)。 結論： 1.成功構建lasI、rhlI基因單、雙突變菌株PA-△lasI、PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI。 2.lasI基因位于rhlI基因的上游并對其有調控作用,當lasI基因缺失突變后,菌株不僅不再合成3-oxo-C12-HSL,而且C4-HSL的量也明顯減少。rhl7基因缺失后,C4-HSL合成被阻斷,但3-oxo-C12-HSL的合成并未受影響。lasI、rhlI雙缺失后HSL信號分子在相應基因缺失后分泌明顯減少。2u g/mL AZM能抑制HSL的分泌。 3.在PA-E.coli接合反應中,本實驗構建的突變菌株PA-△lasI.PA-△rhlI及PA-△lasIrhlI與PA01組比較,HSL信號分子量明顯減少,其接合反應頻率也均降低,這可能是因為HSL在PA的接合轉移中起了重要作用,但具體的機制還有待進一步研究。
【關鍵詞】：銅綠假單胞菌 群體感應系統(tǒng) 同源重組 高絲氨酸內酯 自殺性質粒 接合反應
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 目錄10-12
• 引言12-14
• 第一部分 載體及突變菌株構建14-27
• 1.1 材料14-15
• 1.1.1 菌株14-15
• 1.1.2 主要培養(yǎng)基及抗生素15
• 1.1.3 主要試劑15
• 1.1.4 主要儀器15
• 1.2 實驗方法15-24
• 1.2.1 構建同源重組載體16-19
• 1.2.1.1 pGSM-△lasI載體(串聯lasI基因上下游片段自殺性質粒的構建)16-18
• 1.2.1.2 pGSM-Arhll載體（串聯r/?7/基因上下游片段自殺性質粒的構建）18-19
• 1.2.2 同源重組突變菌株的建立19-20
• 1.2.3 實驗具體操作方法20-23
• 1.2.4 接合轉移23-24
• 1.3 結果24-25
• 1.3.1 載體pGSM-ΔlasI,pGSM-ΔrhlI的鑒定24
• 1.3.2 同源重組構建突變菌株24-25
• 1.4 討論25-27
• 第二部分 突變菌株的鑒定27-38
• 2.1 材料27-28
• 2.1.1 Southern Blot所用試劑及配制方法27
• 2.1.2 HPLC/MS所需試劑及材料27-28
• 2.1.3 HPLC/MS主要儀器28
• 2.2 方法28-31
• 2.2.1 PCR鑒定及基因測序28
• 2.2.2 Souther Blot28-29
• 2.2.3 HPLC-MS(高效液相色譜-串聯質譜)檢測HSL29-31
• 2.3 結果31-36
• 2.3.1 PCR及基因測序對突變菌株的鑒定31-32
• 2.3.2. Southern blot鑒定突變株PA-ΔlasI32-33
• 2.3.3 HPLC/MS檢測33-36
• 2.4 討論36-38
• 第三部分 lasI與rhlI基因缺失對接合反應頻率的影響38-41
• 3.1 材料38
• 3.1.1 菌株與質粒38
• 3.1.2 試劑及儀器38
• 3.2 方法38-39
• 3.2.1 PA生長曲線38
• 3.2.2 接合反應38
• 3.2.3 統(tǒng)計方法38-39
• 3.3 結果39-40
• 3.3.1 PA01野生株及其lasI、rhlI基因單雙缺失菌株的生長曲線39
• 3.3.2 lasI與rhlI基因缺失對接合反應頻率的影響39-40
• 3.4 討論40-41
• 結語41-42
• 參考文獻42-45
• 綜述45-52
• 參考文獻49-52
• 附錄52-54
• 在校期間發(fā)表論文情況54-55
• 致謝55

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

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中國博士學位論文全文數據庫 前2條

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本文編號：762301