本文關(guān)鍵詞：SLC3A2慢病毒載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染精子細(xì)胞的研究

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【摘要】：背景及其目的：精子載體法自運(yùn)用于制備轉(zhuǎn)基因動物以來，它具有操作簡單和費(fèi)用較少的特點(diǎn)；精子自發(fā)吸收外源DNA的天然特點(diǎn)，能使外源基因保持較好的完整性。慢病毒載體利用病毒能將基因整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組，并能穩(wěn)定遺傳的特點(diǎn)，使之成為制備轉(zhuǎn)基因動物的主要工具之一。將精子與慢病毒載體共同孵育，探討外源基因帶入精子細(xì)胞的效率，優(yōu)化篩選出最佳條件，為制備轉(zhuǎn)基因小型豬動物模型奠定基礎(chǔ)，，為相關(guān)研究參考依據(jù)。 方法:1）利用基因工程技術(shù)將目的基因SLC3A2序列片段連接到LV5載體上，構(gòu)建其基因重組載體，然后進(jìn)行病毒包裝，最后用熒光定量PCR進(jìn)行病毒滴度的測定。2）將含基因SLC3A2慢病毒載體與精子細(xì)胞在不同條件下進(jìn)行孵育。1、不同濃度的（104IU/ml，105IU/ml，106IU/ml）慢病毒載體與精子細(xì)胞孵育；2、慢病毒載體與精子分別孵育不同時間（1h，2h，3h，4h）；3、慢病毒載體與精子分別在不同溫度（17℃，25℃，37℃）下孵育；4、不同濃度（0μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL）的Polybrene與慢病毒載體和精子孵育。3）利用免疫熒光法和半定量PCR法檢測在不同條件下，慢病毒載體與精子孵育的轉(zhuǎn)入外源基因的效率；4）用鏡檢法檢測在不同條件下，慢病毒載體與精子孵育的精子細(xì)胞活力。 結(jié)果：1)構(gòu)建了LV5-SLC3A2重組載體，通過酶切鑒定和測序報告判定載體構(gòu)建成功。2）測定的慢病毒載體的平均滴度為2.03×108IU/ml。3）經(jīng)過PCR和免疫熒光法檢測后發(fā)現(xiàn)：SLC3A2在105IU/ml，106IU/ml條件下的水平較高；在孵育2小時后SLC3A2均有表達(dá)；SLC3A2在不同溫度下均有表達(dá)；慢病毒載體和精子細(xì)胞與10μg/mL和15μg/mL的Polybrene孵育后，SLC3A2的水平最高。4）3h，4h組精子細(xì)胞活力顯著低于1h組；17℃組的精子活力較高；15μg/mL的Polybrene和106IU/ml組的精子活力較低。 結(jié)論：1）成功構(gòu)建了SLC3A2慢病毒載體。2）精子細(xì)胞和105IU/ml慢病毒載體在17℃條件下，與10μg/mL的Polybrene共孵育2h時，外源基因SLC3A2轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最佳。
【關(guān)鍵詞】：精子載體法 慢病毒載體 SLC3A2
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392
【目錄】：

• 主要英文縮略詞6-7
• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 前言11-13
• 實(shí)驗(yàn)材料13-18
• 1.1 細(xì)胞株13
• 1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒13
• 1.3 主要試劑與儀器13-15
• 1.4 培養(yǎng)基配置15-16
• 1.5 常規(guī)試劑配置16-18
• 實(shí)驗(yàn)方法18-30
• 2.1 PCR 方法擴(kuò)增 SLC3A2 基因18-21
• 2.2 目的基因 SLC3A2 克隆到載體 LV5 中21-25
• 2.3 重組質(zhì)粒測序驗(yàn)證并大量抽提25
• 2.4 慢病毒包裝及病毒滴度檢測25-27
• 2.5 精子與慢病毒載體孵育法27
• 2.6 提取精子細(xì)胞基因組27-28
• 2.7 用 PCR 檢測精子與慢病毒載體孵育后 SLC3A2 的水平28-29
• 2.8 免疫熒光法檢測不同條件對精子與慢病毒載體孵育的影響29
• 2.9 檢測精子活力29
• 2.10 統(tǒng)計學(xué)分析29-30
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-45
• 3.1 SLC3A2 慢病毒載體的構(gòu)建30-33
• 3.2 檢測在不同條件下慢病毒載體與精子孵育后 SLC3A2 的水平33-42
• 3.3 檢測在不同條件下慢病毒載體與精子孵育對精子活力的影響42-45
• 討論45-49
• 結(jié)論49-50
• 參考文獻(xiàn)50-54
• 文獻(xiàn)綜述54-61
• 參考文獻(xiàn)58-61
• 研究成果61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 ;Beyond Mice:Genetically Modifying Larger Animals to Model Human Diseases[J];遺傳學(xué)報;2012年06期

2 Nana Fan;Liangxue Lai;;Genetically Modified Pig Models for Human Diseases[J];遺傳學(xué)報;2013年02期

本文編號：752923