本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)節(jié)苷脂GD2在大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離和鑒定研究中的應(yīng)用

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【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs),也稱為骨髓基質(zhì)干細胞,是骨髓中的一種成體干細胞,占骨髓來源單核細胞群的比例不到0.01%。一直以來由于沒有找到理想的用于鑒定BM-MSCs的特異性標志,通常采用多種表面分子聯(lián)合鑒定體外培養(yǎng)的BM-MSCs。最近一種新發(fā)現(xiàn)的表面分子神經(jīng)節(jié)苷脂GD2,被用來鑒定人骨髓間充質(zhì)干細胞(BM-MSCs)和臍帶間充質(zhì)干細胞(UC-MSCs)等間充質(zhì)干細胞。但大鼠BM-MSCs是否表達GD2還未見報道,本試驗研究了大鼠BM-MSCs的GD2表達情況,為探索特異性分離、準確鑒定大鼠BM-MSCs提供新的技術(shù)途徑；實驗還應(yīng)用percoll密度梯度離心法對大鼠BM-MSCs的分離方法進行了優(yōu)化,都為獲得可用于移植的高純度BM-MSCs建立了技術(shù)平臺。 實驗一大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表達神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的實驗研究 研究方法：(1) BM-MSCs的分離和體外純化培養(yǎng)：運用全骨髓貼壁法分離8-10周齡SD大鼠BM-MSCs,以1×109個/ml接種于含15%胎牛血清的a-MEM培養(yǎng)基,37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)GD2合成酶mRNA表達的檢測：以大鼠胚胎成纖維細胞(REFs)和小鼠黑色素瘤細胞(B16F10)分別作為陰性和陽性對照,應(yīng)用RT-PCR法檢測第一代、第三代和第五代BM-MSCs的GD2合成酶mRNA表達情況。(3)BM-MSCs膜表面GD2的檢測：應(yīng)用細胞免疫組化法,檢測第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面GD2的表達。(4) BM-MSCs表面分子CD3、CD29、CD45、CD90表達的檢測：應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測第一代、第三代和第五代BM-MSCs表面分子群(CD3、CD2、CD45、CD90)的表達,對BM-MSCs表面分子群的表達結(jié)果與表面分子GD2流式檢測結(jié)果進行比較分析。 結(jié)果：(1)BM-MSCs的培養(yǎng)與傳代：全骨髓貼壁法培養(yǎng)BM-MSCs從原代培養(yǎng)到傳代培養(yǎng)周期很長,需8-10d方可傳代,以后傳代培養(yǎng)周期縮短,每三天即可進行傳代培養(yǎng)。(2) BM-MSCs GD2合成酶mRNA的表達：原代細胞中GD2合成酶mRNA表達較低,隨著傳一、二、三代,細胞內(nèi)GD2合成酶mRNA表達量隨之增加,之后再進行傳代培養(yǎng)顯示GD2合成酶mRNA表達處在一個穩(wěn)定水平。REFs陰性表達GD2合成酶mRNA, B16F10陽性表達GD2合成酶mRNA。(3) BM-MSCs膜表面GD2分子表達：細胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示在第一代、第三代和第五代BM-MSCs的膜表面均表達GD2。(4) BM-MSCs表面分子群的表達：以流式細胞術(shù)檢測BM-MSCs的表面分子群,CD90陽性細胞比率,第一、三、五代分別為59.2%、87.1%、98.2%；CD29陽性細胞比率,第一、三、五代分別為69%、80.9%、99.9%；CD45陽性細胞比率,第一、三、五代分別為13.8%、5.1%、1.1%；CD3陽性細胞比率,第一、三代分別為4.4%、0.8%；GD2陽性細胞比率,第-三、五、七代分別為87.3%、48.2%、36.2%、18.9%。 結(jié)論：(1)全骨髓貼壁法能成功分離培養(yǎng)大鼠BM-MSCs,體外培養(yǎng)的原代BM-MSCs和傳一代、三代、五代的細胞內(nèi)均表達GD2合成酶mRNA和膜表面GD2,與人和小鼠的研究結(jié)果一致,提示GD2種屬間的保守性很高。(2)隨著體外傳代培養(yǎng),細胞內(nèi)GD2合成酶mRNA表達量呈遞增變化而流式檢測細胞表面分子GD2陽性細胞比率呈遞減變化,GD2合成酶是GD2生物合成過程中的一種限速酶,由于BM-MSCs從體內(nèi)到體外環(huán)境的改變,GD2合成酶在mRNA水平表達量增高并沒有提高膜表面GD2分子陽性細胞比率其具體調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。(3)體外傳代培養(yǎng)大鼠BM-MSCs過程中,膜表面分子GD2陽性細胞比率呈遞減變化,說明體外培養(yǎng)的BM-MSCs表面分子GD2的表達逐漸減少,與文獻報道的GD2可以作為鑒定人和小鼠早期MSCs的特異性標志一致。(4)隨著傳代純化培養(yǎng)的進行,通常用于聯(lián)合鑒定的表面分子CD90、CD45陽性細胞比率呈遞增變化,到第五代時CD90、CD45雙陽性細胞比率達98%,細胞純度高,可用于后續(xù)試驗研究。 實驗二應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂GD2分離和鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞 研究方法：(1)采用Percoll密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠BM-MSCs, RT-PCR檢測不同密度梯度層細胞(1.0448g/ml、1.0578g/ml、1.0708g/ml、1.0838g/ml、1.0968g/ml)GD2合成酶mRNA的表達,確定BM-MSCs所處的密度層,為快速獲得BM-MSCs提供依據(jù)。(2)對密度梯度離心法分離獲得的BM-MSCs進行體外培養(yǎng),觀察細胞的形態(tài)及生長特性,采用四甲基噻嘩藍(MTT)比色試驗檢測細胞活力,繪制生長曲線,并與全骨髓貼壁法培養(yǎng)的細胞活力進行比較。(3)應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測密度梯度離心分離得到的BM-MSCs表面分子群(CD3、CD29、CD45、CD90)的表達,檢測其純度。 結(jié)果：(1)RT-PCR試驗結(jié)果顯示,僅在1.0708g/ml這一密度層的細胞有GD2合成酶mRNA的表達。(2)密度梯度離心得到的細胞接種后,剛開始增殖慢,適應(yīng)一段時間后,經(jīng)6-7d原代培養(yǎng)后即可進行傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)的周期為2-3d,與全骨髓貼壁法傳代培養(yǎng)的周期相近。MTT檢測發(fā)現(xiàn)傳代后的細胞活力較高,對數(shù)生長期的細胞在接種后15h左右。(3)密度梯度離心獲得的細胞經(jīng)體外培養(yǎng),流式細胞檢測一代細胞表面分子CD90、CD29、CD45、CD3陽性細胞比率分別為88.5%、99.9%、0.2%、0.1%,其純度高于全骨髓貼壁法獲得的一代細胞。 結(jié)論：Percoll密度梯度離心法能夠快速獲得BM-MSCs,離心過程中細胞受到一定損傷,接種培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)貼壁所需的時間較貼壁分離法長,一般原代培養(yǎng)6-7d可進行傳代培養(yǎng)。傳代后的細胞活力增高,增殖快；流式細胞檢測密度梯度獲得的傳一代BM-MSCs表面分子群CD3、CD29、CD45、CD90陽性細胞比率比全骨髓貼壁法獲得的一代細胞的純度高。傳一代后細胞形態(tài)趨于一致,采用MTT比色檢測密度梯度離心獲得的一代、二代、三代生長良好的細胞活力,繪制生長曲線,與全骨髓貼壁法培養(yǎng)的一代、二代、三代細胞進行比較。密度梯度離心得到的細胞活力高于全骨髓貼壁法,且密度梯度離心培養(yǎng)的細胞對數(shù)生長期在接種后的15h左右,相比貼壁細胞的24h,其增殖周期縮短,細胞活力高。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 骨髓間充質(zhì)干細胞 雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂 鑒定 密度梯度離心
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-9
• 目錄9-10
• 符號說明10-11
• 文獻綜述11-26
• 1. 神經(jīng)節(jié)苷脂11-16
• 1.1 神經(jīng)節(jié)苷脂的結(jié)構(gòu)和分布11
• 1.2 神經(jīng)節(jié)苷脂的生物學(xué)功能11-12
• 1.3 神經(jīng)節(jié)苷脂在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的作用12-13
• 1.4 神經(jīng)節(jié)苷脂與神經(jīng)疾病13
• 1.5 神經(jīng)節(jié)苷脂與腫瘤疾病13-14
• 1.6 神經(jīng)節(jié)苷脂是一些神經(jīng)細胞特有標記物14-15
• 1.7 GD2的生物學(xué)特性15-16
• 2. 骨髓間充質(zhì)干細胞16-20
• 2.1 BM-MSCs概述16
• 2.2 BM-MSCs的形態(tài)特征16-17
• 2.3 BM-MSCs的分化潛能17-18
• 2.4 BM-MSCs的分離和培養(yǎng)18
• 2.5 BM-MSCs的鑒定18-20
• 參考文獻20-26
• 研究論文26-55
• 第一章 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表達神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的研究26-48
• 1. 實驗材料26-29
• 2. 實驗方法29-35
• 3. 結(jié)果35-46
• 4. 討論46-48
• 第二章 應(yīng)用神經(jīng)節(jié)苷脂GD2分離鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞48-55
• 1. 實驗材料48
• 2. 實驗方法48-50
• 3. 結(jié)果50-53
• 4. 討論53-55
• 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻56-58
• 致謝58-59
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄59-60

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 邱麗燕,王金福;骨髓間充質(zhì)干細胞的研究進展[J];生物工程學(xué)報;2003年02期

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本文編號：749802