本文關鍵詞：不同佐劑下幽門螺桿菌UreB疫苗的Th表位優(yōu)勢應答研究

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【摘要】：背景： 幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， Hp）是定植于人胃粘膜及十二指腸粘膜局部的革蘭陰性桿菌。全球范圍感染率超過50%，與慢性胃炎，消化性潰瘍及胃粘膜相關淋巴組織淋巴瘤密切相關，已被世界衛(wèi)生組織列為人類的一類致病因子。目前臨床上主要通過聯用多種抗生素與質子泵抑制劑對Hp感染患者進行治療。但由此產生的抗生素耐藥問題越來越突出，同時還存在患者依從性差及再次感染率高等問題，因此研發(fā)新的抗菌疫苗以預防或清除局部Hp已十分必要。 目前針對Hp所設計的全菌疫苗，可誘導機體產生有效的保護性應答，但因其抗原成分復雜常導致較多的副反應發(fā)生。而通過重組表達某一抗原成分設計的亞單位疫苗不僅可誘導機體產生特異性免疫應答反應，而且安全性更高。然而在疫苗研發(fā)過程中發(fā)現，同一蛋白抗原分別采用不同佐劑或同一佐劑的不同免疫途徑進行疫苗接種后，往往出現截然不同的免疫保護效果。Hp為一種胞外感染菌，可誘導機體產生強烈的CD4+T細胞應答，已經證實特異性CD4+T細胞免疫應答在機體抗Hp感染過程中發(fā)揮重要的免疫保護作用。而抗原所激發(fā)的特異性CD4+T細胞應答主要由抗原中的某一個或幾個表位所誘導。因此我們推測基于同一保護性抗原的亞單位疫苗，輔以不同的佐劑或同一佐劑的不同免疫途徑，所產生的免疫保護效果差異可能由于特異性CD4+T細胞對應顯性表位應答的不同所造成。 Hp尿素酶被證實與Hp的感染、定植密切相關，其通過分解尿素產氨以中和胃粘膜局部的H+，產生適于Hp定植的微環(huán)境。尿素酶包含兩個亞基即A亞單位（UreA）和B亞單位（UreB）。其中UreB可誘導機體產生強烈的免疫應答，且核苷酸和氨基酸序列高度保守是目前公認的Hp保護性抗原。因此本課題選取UreB作為研究對象，分別輔以弗氏佐劑、CpG和AddaVax三種不同佐劑進行皮下免疫接種，以及CpG佐劑的皮下和滴鼻兩種途徑免疫小鼠，采用步移合成重疊肽方法和細胞內因子染色、流式細胞術等對特異性CD4+T細胞的顯性表位應答特性進行分析。探尋不同佐劑或免疫途徑下表位特異性優(yōu)勢應答的差異，揭示不同佐劑或免疫途徑下免疫保護作用差異的內在原因。 目的： 以UreB為研究對象，通過對特異性CD4+T細胞的顯性表位優(yōu)勢應答特性分析為同一保護性抗原的不同佐劑疫苗或同一佐劑疫苗的不同免疫途徑所產生的保護效果差異提出新的解析，為基于表位設計的Hp疫苗研究提供候選分子和實驗依據，也為Hp疫苗的保護性應答監(jiān)測提供有效方法。 方法： 1、幽門螺桿菌培養(yǎng)。 選擇在BALB/c小鼠模型中定植量較高的幽門螺桿菌菌株B6進行培養(yǎng)。調整細菌濃度為109CFU/ml用于感染攻毒。 2、小鼠免疫攻毒。 分別采用CpG，AddaVax，弗氏佐劑聯合UreB抗原皮下注射免疫小鼠。CpG分別采用皮下和滴鼻進行免疫。表位免疫均采用滴鼻免疫，佐劑選擇CpG。末次免疫后1周行Hp攻毒。 3、特異性抗體檢測。 采用ELISA法分別檢測血清和胃粘膜局部的IgG抗體和IgA抗體。判斷其體液免疫應答情況。 4、胃粘膜Hp定植量檢測 末次攻毒后4周，提取小鼠胃粘膜局部DNA，采用實時定量PCR檢測幽門螺桿菌16SrDNA。判斷胃粘膜局部Hp定植情況。 5、特異性T細胞擴增。 收集免疫后小鼠的脾臟，研磨成單細胞懸液，經小鼠淋巴細胞分離液分離，收集單個核細胞，在白介素存在的條件下體外經抗原或肽刺激進行特異性T細胞的擴增。 6、誘導小鼠骨髓源DCs與遞呈實驗。 收集小鼠骨髓，制成單細胞懸液后裂解紅細胞，剩余細胞在相應細胞因子的刺激下分化發(fā)育為DCs。成熟的DCs預負載抗原1h后與特異性細胞共培養(yǎng)，用于遞呈實驗。 7、細胞內因子染色。 在高爾基體阻斷劑存在的條件下，采用合適的刺激物刺激特異性細胞合成細胞因子5h，之后用熒光抗體標記細胞表面分子及細胞內因子。最后進行流式分析。 8、數據分析 胃粘膜局部Hp定植量檢測采用非配對T檢驗。其它數據均采用單因素方差分析。所有數據均采用平均數±標準差表示。p≤0.05視為有統計學意義。 結果： 1、UreB聯合不同佐劑免疫小鼠可誘導產生有差異的免疫保護作用。CpG疫苗滴鼻組和弗氏佐劑疫苗皮下注射組小鼠胃粘膜幽門螺桿菌定植量較其它免疫組和PBS對照組顯著降低（P0.01），而其它免疫組與PBS對照組相比無顯著差異，但CpG疫苗皮下組、AddaVax疫苗皮下組的Hp定植數量略低于PBS對照組。 2、體外從抗原免疫組小鼠脾臟中成功擴增出抗原特異性CD4+T細胞，其比例可達到10%，而未免疫組即PBS對照組未見陽性信號。 3、從UreB抗原中篩選到4個優(yōu)勢應答表位，AddaVax佐劑皮下免疫組優(yōu)勢應答表位為UreB485-497（AKYDANITFVSQA），而弗氏佐劑及CpG佐劑皮下免疫組均可誘導產生針對UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）和UreB409-421（YTINPAIAHGISE）的表位特異性細胞應答， CpG佐劑滴鼻免疫組優(yōu)勢應答表位為UreB373-390（ITRTWQTADKNKKEFGRL）。 4、顯性表位UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）、UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA）的應答均可被MHC-Ⅱ（I-A）單克隆抗體特異性阻斷。 5、對顯性表位進行免疫保護性評估發(fā)現UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）表位免疫組胃粘膜Hp定植量顯著降低（P＜0.001），而表位UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA）免疫組與PBS對照組相比無統計學差異。 結論： 1、針對同一保護性抗原應用不同的佐劑可誘導機體產生不同的表位特異性CD4+T細胞優(yōu)勢應答。 2、針對同一保護性抗原，，同一佐劑的不同免疫途徑可激發(fā)機體產生不同的表位特異性CD4+T細胞優(yōu)勢應答。 3、采用步移合成重疊肽法，從UreB中篩選鑒定出4個新的Th顯性表位UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）、UreB409-421（YTINPAIAHGISE）和UreB485-497（AKYDANITFVSQA），可通過MHC-Ⅱ（I-A）限制性自然遞呈，并誘導Th1細胞優(yōu)勢應答。 4、四個Th顯性表位中UreB317-329（MLMVCHHLDKSIK）、UreB373-385（ITRTWQTADKNKK）具有顯著的抗Hp感染的免疫保護作用。
【關鍵詞】：幽門螺桿菌 尿素酶B亞單位 Th表位 免疫佐劑
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378;R392
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• Abstract5-10
• 摘要10-14
• 1.前言14-16
• 2.實驗材料16-20
• 3.實驗方法20-32
• 4.結果32-47
• 5.討論47-51
• 全文總結51-52
• 本研究的創(chuàng)新、不足和展望52-53
• 參考文獻53-57
• 文獻綜述 幽門螺桿菌尿素酶 B 亞單位相關疫苗的研究進展57-65
• 參考文獻62-65
• 在讀期間發(fā)表的論文65-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前3條

1 孫波,楊驊,李兆申,屠振興,龔燕芳,杜奕奇;幽門螺桿菌UreB-NAP-HpaA三價DNA疫苗的構建及免疫原性初步研究[J];第二軍醫(yī)大學學報;2005年06期

2 袁小澎;鄒全明;柏楊;張衛(wèi)軍;郭剛;謝慶華;劉開云;吳超;;幽門螺桿菌多亞單位融合蛋白疫苗的構建及免疫特性[J];中國生物制品學雜志;2007年07期

3 袁小澎;鄒全明;洪愉;柏楊;吳超;張衛(wèi)軍;;幽門螺桿菌雙亞單位基因疫苗的構建及免疫原性研究[J];中國免疫學雜志;2007年08期

本文編號：744601