發(fā)布時間：2017-08-23 08:22

  本文關(guān)鍵詞：傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬通量的影響和作用時相的研究

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【摘要】：目的： 研究傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar typhi, S.typhi）質(zhì)粒pR_(ST98)對巨噬細(xì)胞自噬動態(tài)過程的影響，探討該質(zhì)粒與沙門菌感染時巨噬細(xì)胞自噬體及自噬溶酶體的關(guān)系，揭示pR_(ST98)對自噬通量（autophagic flux）的作用時相，為通過調(diào)控細(xì)胞自噬水平來防治細(xì)菌感染的新策略及新藥研發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。 方法： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬的影響 以攜帶pR_(ST98)的傷寒沙門菌野生株ST8，消除pR_(ST98)的傷寒沙門菌突變株ST8-ΔpR_(ST98)和將pR_(ST98)經(jīng)接合轉(zhuǎn)移重新導(dǎo)入ST8-ΔpR_(ST98)所獲得的回補(bǔ)株ST8-c-pR_(ST98)，按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）100:1感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞J774A.1，建立細(xì)胞感染模型，同時設(shè)自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（rapamycin，RAPA）干預(yù)組。分別于細(xì)胞感染后1~3h收集細(xì)胞，透射電鏡（transmission electronmicroscope，TEM）觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）和免疫印跡法（western blot，WB）檢測自噬蛋白LC3-II、Beclin-1的表達(dá)；用紅色和綠色熒光蛋白偶聯(lián)的LC3真核細(xì)胞表達(dá)載體mRFP-GFP-LC3瞬時轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞，共聚焦激光顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察LC3-II點(diǎn)狀聚集，并用免疫組化法做平行對照；平板菌落計數(shù)法檢測胞內(nèi)活菌數(shù)（colony-forming unit，CFU）。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬通量及作用時相的影響 由于傷寒沙門菌的嚴(yán)格宿主特異性，使其缺乏理想的動物模型，為今后進(jìn)一步在動物活體內(nèi)研究pR_(ST98)與細(xì)胞自噬的關(guān)系，本部分實驗用與傷寒沙門菌有非常近緣關(guān)系的鼠傷寒沙門菌作為研究對象，研究該質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬通量的影響。以攜帶一分子量為100kb毒力質(zhì)粒的鼠傷寒沙門菌（Salmonella enterica serovar typhimurium，S.typhimurium）標(biāo)準(zhǔn)毒株χ~(3306)、將其質(zhì)粒消除后獲得的鼠傷寒沙門菌突變株χ~(3337)和將質(zhì)粒pR_(ST98)經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入χ~(3337)后形成的鼠傷寒沙門菌接合子χ~(3337)/pR_(ST98)為受試菌，同第一部分建立感染模型。分別設(shè)饑餓誘導(dǎo)組（無血清RPMI1640培養(yǎng)液處理細(xì)胞）、溶酶體抑制劑氯喹（chloroquine，CQ）干預(yù)組和常規(guī)細(xì)胞感染模型組。于感染后1h收集細(xì)胞，用Giemsa染色法觀察各感染組細(xì)胞狀態(tài)及感染情況；CLSM觀察轉(zhuǎn)染mRFP-GFP-LC3的巨噬細(xì)胞內(nèi)自噬蛋白LC3-II的點(diǎn)狀聚集；WB檢測自噬標(biāo)記蛋白LC3-II及自噬底物蛋白p62的表達(dá)；將熒光素酶報告基因lux導(dǎo)入以上3株受試菌染色體，獲得發(fā)光菌χ~(3306)lux、χ~(3337)lux及χ~(3337)/pR_(ST98)lux，用小動物成像儀檢測相應(yīng)細(xì)菌的生物發(fā)光量，直接分析感染細(xì)胞內(nèi)CFU。 結(jié)果： 一、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬的影響 （1）TEM結(jié)果顯示，感染后1~3h，ST8-ΔpR_(ST98)感染組細(xì)胞中可觀察到典型的自噬體和自噬溶酶體；ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組少見或未見到上述結(jié)構(gòu)，但可見大量細(xì)菌的存在。 （2）CLSM檢測LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)統(tǒng)計結(jié)果顯示，感染后1h，ST8-ΔpR_(ST98)感染組細(xì)胞內(nèi)LC3點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量明顯高于ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組（p0.05）；RAPA干預(yù)后，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)均有增加（p0.05），但各感染組之間無顯著差異。 （3）FCM和WB檢測結(jié)果顯示，感染后1h，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組細(xì)胞自噬蛋白LC3-II和Beclin-1的表達(dá)量均低于ST8-ΔpR_(ST98)感染組（p0.05）；RAPA干預(yù)后，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組LC3-II、Beclin-1的表達(dá)量均增加（p0.05），但各感染組之間無顯著差異。 （4）平板菌落計數(shù)法計數(shù)胞內(nèi)CFU結(jié)果顯示，感染后1h，ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組胞內(nèi)CFU高于ST8-ΔpR_(ST98)感染組（p0.05）；RAPA干預(yù)后，趨勢不變。感染后3h，RAPA干預(yù)的ST8和ST8-c-pR_(ST98)感染組胞內(nèi)CFU減少均低于未干預(yù)組（p0.05），而ST8-ΔpR_(ST98)感染組未見顯著變化。 二、傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬通量及作用時相的影響 （1）Giemsa染色結(jié)果顯示，感染后1h，常規(guī)感染組細(xì)胞內(nèi)未見或少見空泡，所見空泡內(nèi)常包裹細(xì)菌；CQ干預(yù)后，細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)均勻空泡，細(xì)胞略有腫脹，各感染組胞內(nèi)細(xì)菌增多；饑餓誘導(dǎo)下，巨噬細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不均勻的空泡，胞內(nèi)細(xì)菌量低于未誘導(dǎo)組。 （2）CLSM檢測結(jié)果顯示，感染后1h，χ~(3337)感染組細(xì)胞內(nèi)黃色熒光聚集結(jié)構(gòu)（自噬體）多于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染組，CQ干預(yù)后黃色熒光差異更加顯著；紅色熒光聚集結(jié)構(gòu)（自噬溶酶體）則未見明顯差異；饑餓誘導(dǎo)后，χ~(3337)感染組平均每個細(xì)胞中自噬體顯著多于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染組（p0.01），，自噬溶酶體各感染組差別無統(tǒng)計學(xué)意義。 （3）WB檢測結(jié)果顯示，感染后1h，χ~(3337)感染組細(xì)胞LC3-II表達(dá)量高于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染組，而p62表達(dá)量則低于后兩組；CQ干預(yù)后，各組感染細(xì)胞LC3-II表達(dá)差異與常規(guī)感染模型一致，即χ~(3337)感染組細(xì)胞高于χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染組，但差異更加顯著，p62表達(dá)水平各感染組間差異不顯著。 （4）小動物成像儀檢測胞內(nèi)CFU結(jié)果顯示，感染后1h，χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染組胞內(nèi)CFU顯著高于χ~(3337)感染組（p0.05）；CQ干預(yù)后，各感染組胞內(nèi)CFU無顯著差異。饑餓誘導(dǎo)后，χ~(3306)和χ~(3337)/pR_(ST98)感染組胞內(nèi)CFU均低于未誘導(dǎo)對照組（p0.01）。 結(jié)論： 1.傷寒沙門菌質(zhì)粒pR_(ST98)可抑制巨噬細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)細(xì)菌增殖。 2.傷寒沙門菌質(zhì)粒pR_(ST98)對巨噬細(xì)胞自噬通量的作用時相為自噬動態(tài)過程的早期階段，即自噬體形成階段。 3.攜帶質(zhì)粒pR_(ST98)的沙門菌感染巨噬細(xì)胞時，用藥物上調(diào)細(xì)胞自噬活性，可抑制細(xì)菌增殖，減輕感染。
【關(guān)鍵詞】：傷寒沙門菌 質(zhì)粒 巨噬細(xì)胞 自噬通量
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.22
【目錄】：

• 中文提要4-7
• Abstract7-11
• 引言11-14
• 第一部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬的影響14-26
• 1 材料與方法15-20
• 2 結(jié)果20-26
• 第二部分 傷寒沙門菌質(zhì)粒對巨噬細(xì)胞自噬通量及作用時相的影響26-39
• 1 材料與方法27-29
• 2 結(jié)果29-36
• 3 討論36-39
• 參考文獻(xiàn)39-42
• 綜述 傷寒沙門菌動物模型研究進(jìn)展42-48
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 攻讀碩士學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文48
• 本課題所獲基金資助48-49
• 英文縮略詞表49-50
• 致謝50-51

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 吳淑燕;李瓊;儲元元;李Z腦

本文編號：723981