本文關(guān)鍵詞：間日瘧疾傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25在家蠶桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)研究

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【摘要】：間日瘧(Vivax malaria)是由間日瘧原蟲(chóng)(Plasmodium vivax)引起的周期性發(fā)作的急性傳染病，特點(diǎn)是間隔48小時(shí)反復(fù)發(fā)作。如今已有的抗瘧疾藥物也由于抗藥性瘧原蟲(chóng)以及耐殺蟲(chóng)劑傳播蚊的出現(xiàn)而面臨挑戰(zhàn)。制備瘧疾疫苗也就成為了能有效控制瘧疾傳播的主要手段。其中傳播阻斷疫苗（transmission blocking vaccines，TBVs）是以蚊蟲(chóng)階段瘧原蟲(chóng)特異表達(dá)的蟲(chóng)體表面蛋白作為抗原免疫人體，使之產(chǎn)生抗蚊階段瘧原蟲(chóng)表面蛋白的特異性抗體。間日瘧傳播阻斷疫苗候選抗原Pvs25是瘧疾研究的主要靶點(diǎn)，，其在不同地區(qū)的瘧疾病毒株間具有很高的保守性。 Pvs25是在合子以及動(dòng)合子表面表達(dá)的蛋白，分子量為25kDa，含有22個(gè)半胱氨酸形成的11個(gè)二硫鍵，序列含有4個(gè)類表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域(EGF-like Domain)。本課題通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-Pvs25獲得工程菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后重組蛋白大量表達(dá)；從誘導(dǎo)菌體超聲破碎后的上清中提取重組蛋白，經(jīng)Ni親和層析純化后，獲得重組蛋白純度達(dá)到95%；將純化后的重組蛋白免疫Balb/c雌鼠制備多克隆抗體；純化后的抗體經(jīng)間接ELISA測(cè)定效價(jià)為1：12800。同時(shí)，利用家蠶生物反應(yīng)器平臺(tái)的Bac-to-Bac系統(tǒng)成功獲得重組桿狀病毒vBm-Pvs25，感染家蠶細(xì)胞、家蠶五齡幼蟲(chóng)，Western Blotting分析結(jié)果顯示，目的蛋白表達(dá)成功。構(gòu)建BmCMV-gp64-Pvs25，在載體的多角體啟動(dòng)子前面串聯(lián)一個(gè)CMV啟動(dòng)子序列，這樣表達(dá)的重組蛋白Pvs25不僅可以在BmNPV的表面展示，而且可以在哺乳動(dòng)物體內(nèi)展示。獲得重組桿狀病毒vBmCMV-gp64-Pvs25，用于感染家蠶細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE、WesternBlotting分析、激光共聚焦觀察，發(fā)現(xiàn)目的蛋白成功表達(dá)并展示于質(zhì)膜表面。利用純化得到的vBmCMVgp64-Pvs25病毒粒子免疫Balb/c小鼠獲取抗血清，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行研究，結(jié)果表明其中和效價(jià)為1：25600，可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)反應(yīng)。本課題為間日瘧傳播阻斷疫苗的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：傳播阻斷疫苗 候選抗原 Pvs25 桿狀病毒 表面展示技術(shù) vBmCMV-gp64-Pvs25
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R531.3;R392
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 目錄7-12
• 縮略語(yǔ)12-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)13-23
• 第一章 緒論14-21
• 第一節(jié) 瘧疾疫苗的概述14-17
• 1.1 紅前期疫苗15
• 1.2 紅內(nèi)期疫苗15-16
• 1.3 傳播阻斷疫苗16-17
• 1.4 展望17
• 第二節(jié) 間日瘧傳播阻斷疫苗 Pvs25 研究進(jìn)展17-18
• 第三節(jié) 桿狀病毒研究進(jìn)展18-21
• 3.1 家蠶核型多角體 BmNPV 表達(dá)載體系統(tǒng)18-19
• 3.2 家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)19
• 3.3 家蠶桿狀病毒表面展示技術(shù)19-21
• 第二章 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)21-23
• 1 研究目的及意義21
• 2 研究?jī)?nèi)容21-22
• 3 實(shí)驗(yàn)流程圖22-23
• 第二部分 研究論文23-63
• 第一章 生物信息學(xué)分析24-29
• 1 生物信息學(xué)分析工具24
• 2 分析方法與結(jié)果24-29
• 2.1 Pvs25 基因序列24-25
• 2.2 CMV 的基因序列25
• 2.3 Pvs25 的疏水性分析25-26
• 2.4 Pvs25 的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)26-27
• 2.5 Pvs25 的信號(hào)肽預(yù)測(cè)27
• 2.6 Pvs25 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)27
• 2.7 Pvs25 的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)27-28
• 2.8 討論28-29
• 第二章 間日瘧傳播阻斷候選抗原 Pvs25 的原核表達(dá)29-41
• 1 材料和試劑29-32
• 1.1 材料和試劑29
• 1.2 試劑配制29-32
• 2 方法32-38
• 2.1 PCR 擴(kuò)增目的片段32-33
• 2.2 PCR 產(chǎn)物與 pET-32a 載體的雙酶切33
• 2.3 酶切產(chǎn)物回收33
• 2.4 Pvs25 基因和 pET-32a 質(zhì)粒連接反應(yīng)33-34
• 2.5 Rosetta 和 TG1 感受態(tài)細(xì)胞的制備34
• 2.6 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化34
• 2.7 重組陽(yáng)性克隆的鑒定34-35
• 2.8 重組菌的表達(dá)35-37
• 2.8.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化35
• 2.8.2 重組表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)35
• 2.8.3 SDS-PAGE 電泳分析35
• 2.8.4 融合蛋白 Pvs25 的表達(dá)的 Western Blotting 鑒定35-36
• 2.8.5 融合蛋白 Pvs25 的大量表達(dá)和 Ni 柱純化36-37
• 2.8.6 目的蛋白定量和濃縮37
• 2.9 多克隆鼠抗的制備37-38
• 2.9.1 免疫動(dòng)物37
• 2.9.2 多克隆抗血清的制備37
• 2.9.3 抗體純化37
• 2.9.4 抗體效價(jià)測(cè)定37-38
• 3 結(jié)果與分析38-40
• 3.1 Pvs25 基因的 PCR 擴(kuò)增和表達(dá)載體 pET-32a-Pvs25 的構(gòu)建38-39
• 3.2 pET-32a-Pvs25 的原核表達(dá)鑒定39
• 3.3 pET-32a-Pvs25 的原核表達(dá)純化39-40
• 3.4 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定40
• 4 討論40-41
• 第三章 間日瘧傳播阻斷候選抗原 Pvs25 在家蠶桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)41-50
• 1 材料與試劑41-42
• 1.1 材料與試劑41
• 1.2 試劑配制41-42
• 2 方法42-46
• 2.1 重組質(zhì)粒 pFastBacHTB-Pvs25 的構(gòu)建42
• 2.1.1 Pvs25 片段的 PCR 擴(kuò)增42
• 2.1.2 pFastBacHTB 和 Pvs25 片段的雙酶切42
• 2.1.3 連接反應(yīng)42
• 2.2 重組病毒基因組 Bacmid-BmPvs25 的構(gòu)建42-44
• 2.2.1 DH10Bac 感受態(tài)的制備42
• 2.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化42-43
• 2.2.3 重組 Bacmid 的提取43
• 2.2.4 重組 Bacmid 的鑒定43-44
• 2.3 重組病毒 vBmPvs25 的構(gòu)建44-45
• 2.3.1 重組病毒基因組通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶 BmN 細(xì)胞44-45
• 2.3.2 重組病毒的 PCR 鑒定45
• 2.3.3 重組病毒的擴(kuò)增以及病毒滴度測(cè)定45
• 2.4 重組蛋白 Pvs25 在家蠶 BmN 細(xì)胞中的表達(dá)和鑒定45-46
• 2.5 重組蛋白 Pvs25 在家蠶五齡幼蟲(chóng)中的表達(dá)和鑒定46
• 2.5.1 重組病毒 vBmPvs25 感染家蠶五焌幼蟲(chóng)46
• 2.5.2 Western Blotting 鑒定融合蛋白 Pvs25 的表達(dá)46
• 3 結(jié)果與分析46-49
• 3.1 重組質(zhì)粒 pFastBacHTB Pvs25 的構(gòu)建的鑒定46
• 3.2 重組病毒 vBmPvs25 的鑒定46-47
• 3.3 Western Blotting 鑒定 Pvs25 蛋白在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)情況47-48
• 3.4 Western Blotting 鑒定 Pvs25 在家蠶幼蟲(chóng)中的表達(dá)48-49
• 4 討論49-50
• 第四章 Pvs25 蛋白的桿狀病毒表面展示的研究50-63
• 1 材料與試劑50
• 1.1 材料與試劑50
• 2 方法50-55
• 2.1 引物設(shè)計(jì)與 Pvs25 基因的獲得50-51
• 2.2 重組質(zhì)粒 pFastBacDual-CMV-SP-TM 的獲得51
• 2.3 重組質(zhì)粒 pFastBacDual-CMV-SP-Pvs25-TM 的構(gòu)建51-52
• 2.4 重組病毒基因組 Bacmid-CMV-gp64-Pvs25 的構(gòu)建52-53
• 2.4.1 DH10Bac 菌感受態(tài)的制備52
• 2.4.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化52
• 2.4.3 重組 Bacmid 的提取52
• 2.4.4 重組 Bacmid PCR 鑒定52-53
• 2.5 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的構(gòu)建53-54
• 2.5.1 重組病毒基因組通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染家蠶 BmN 細(xì)胞53
• 2.5.2 重組病毒的基因組提取以及 PCR 鑒定53-54
• 2.5.3 重組病毒的擴(kuò)增和重組病毒滴度測(cè)定54
• 2.6 目的蛋白 Pvs25 在家蠶 BmN 細(xì)胞中的表達(dá)和鑒定54
• 2.6.1 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 感染家蠶 BmN 細(xì)胞54
• 2.6.2 Western Blotting 鑒定蛋白表達(dá)54
• 2.7 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的大量擴(kuò)增54
• 2.8 重組病毒粒子的純化54
• 2.9 免疫細(xì)胞方法檢測(cè) vBmCMV-gp64-Pvs25 在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)54-55
• 2.10 純化的重組病毒粒子免疫小鼠55
• 2.11 抗體的效價(jià)測(cè)定55
• 3 結(jié)果與分析55-61
• 3.1 重組質(zhì)粒 pFastBacDualCMV-gp64-SP-Pvs25-TM 的構(gòu)建55-57
• 3.1.1 PCR 擴(kuò)增 Pvs25 完整的 ORF 序列結(jié)果55-56
• 3.1.2 重組供體質(zhì)粒 pFastBacDualCMV-gp64-SP-Pvs25-TM 的鑒定56-57
• 3.2 重組 Bacmid PCR 鑒定57
• 3.3 重組病毒 vBmCMV-gp64-Pvs25 的鑒定57-58
• 3.4 Western Blotting 鑒定 Pvs25 蛋白在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)58-59
• 3.5 免疫細(xì)胞方法檢測(cè) Pvs25 蛋白在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)59-60
• 3.6 抗體的效價(jià)測(cè)定60-61
• 4 討論61-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻(xiàn)64-69
• 致謝69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Genetic Modification of Baculovirus Expression Vectors[J];Virologica Sinica;2012年02期

本文編號(hào)：719865