本文關鍵詞：南極磷蝦胰蛋白酶表達載體構建與高效表達

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【摘要】：南極磷蝦屬節(jié)肢動物門甲殼綱磷蝦目，這種無脊椎動物是南極海域的關鍵物種，主要圍繞極地分布并集中于南冰洋，為多細胞生物中生物質能最大、適應環(huán)境最成功的動物物種之一。 特殊寒冷的生活環(huán)境造就了南極磷蝦體內很多活性物質都具有較高的研究價值，其中以胰蛋白酶的低溫高效性較為突出。南極磷蝦胰蛋白酶已經在清除機體壞死組織、治療角膜堿燒傷以及清除牙斑等醫(yī)學領域得到了廣泛的應用，并且成為輕工業(yè)、食品、醫(yī)藥等學科的研究熱點。 由于磷蝦樣品提取胰蛋白酶的現實困難和相對高昂的成本，本實驗采用基因工程技術將南極磷蝦胰蛋白酶基因轉入工程菌中，利用基因工程技術表達目的蛋白并初步純化,為南極磷蝦胰蛋白酶的研究提供更加深入的資料和依據。 【研究內容】（1）以南極磷蝦mRNA為模板，通過分析南極磷蝦胰蛋白酶基因，設計基因特異性引 物，逆轉錄得到南極磷蝦胰蛋白酶cDNA。（2）構建pGEX-2T-TRY（TRY代表南極磷蝦胰蛋白酶）原核表達載體，轉化感受態(tài)細 胞，并經PCR、雙酶切及測序進行鑒定。（3）將pGEX-2T-TRY轉化入工程菌E.coli BL21，優(yōu)化表達條件，以實現目的蛋白的 表達。（4）工程菌經超聲裂解，獲得目的蛋白。檢測目的蛋白的酶解活性并對目的蛋白初步 純化。 【研究結果】（1）利用TAIL-PCR技術獲得基因序列，經分析比對確認為南極磷蝦胰蛋白酶基因， 設計基因特異性引物，以南極磷蝦RNA為模板成功逆轉錄出cDNA。（2）構建的pGEX-2T-TRY原核表達載體，經PCR和雙酶切以及測序鑒定證明已構建成 功。（3）工程菌E.coli BL21經IPTG誘導后，成功表達出融合蛋白，經SDS-PAGE電泳結 果分析，發(fā)現在55KDa處有明顯的目的蛋白條帶，與預期的結果一致。（4）選用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠來純化帶有GST標簽的融合蛋白，初步純化出目的蛋白， 但是尚未發(fā)現該蛋白具有酶活性。 【研究結論】 本實驗成功構建了原核表達南極磷蝦胰蛋白酶的工程菌，經IPTG誘導表達出帶有GST標簽的目的蛋白，經SDS-PAGE分析證明，在預期位置有明顯的蛋白條帶，，批量發(fā)酵菌體后，超聲破菌回收蛋白，對目的蛋白進行了初步純化和酶活性檢測。
【關鍵詞】：南極磷蝦 胰蛋白酶 TAIL-PCR 克隆 載體構建 表達 純化
【學位授予單位】：濟南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 導師簡介5
• 課題組成員5-9
• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 主要符號表13-14
• 第一部分 前言14-18
• 1.1 南極磷蝦研究開發(fā)現狀14-15
• 1.2 胰蛋白酶的研究現狀15-16
• 1.3 南極磷蝦酶的應用價值16-18
• 第二部分 南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA 的克隆與鑒定18-37
• 2.1 實驗儀器與材料18-20
• 2.1.1 實驗組織樣本18
• 2.1.2 試劑18-19
• 2.1.3 主要儀器19-20
• 2.2 實驗方法20-28
• 2.2.1 南極磷蝦基因組 DNA 的獲得20
• 2.2.2 南極磷蝦胰蛋白酶基因片段的獲得20-22
• 2.2.3 南極磷蝦胰蛋白酶全基因序列的獲得22-26
• 2.2.4 南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA 的獲得26-28
• 2.3 實驗結果28-35
• 2.3.1 提取南極磷蝦胰蛋白酶基因克隆結果28-30
• 2.3.2 重組質粒 PCR 及酶切鑒定30
• 2.3.3 南極磷蝦胰蛋白酶的全基因序列圖及開放閱讀框（ORF）結構圖30-32
• 2.3.4 南極磷蝦總 RNA 電泳結果32
• 2.3.5 南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA 電泳結果32-33
• 2.3.6 多物種胰蛋白酶氨基酸多序列分析33-34
• 2.3.7 系統(tǒng)進化樹分析34-35
• 2.4 討論35-36
• 2.5 結論36-37
• 第三部分 南極磷蝦胰蛋白酶基因表達載體的構建37-45
• 3.1 實驗材料和試劑37-38
• 3.1.1 菌株與載體37
• 3.1.2 LB 固體和液體培養(yǎng)基37
• 3.1.3 實驗試劑37
• 3.1.4 主要儀器37-38
• 3.2 實驗方法38-40
• 3.2.1 質粒 pGEX-2T 的驗證38
• 3.2.2 雙酶切南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA38-39
• 3.2.3 雙酶切質粒 pGEX-2T39
• 3.2.4 連接并轉化 E.coli BL21 感受態(tài)細胞39-40
• 3.2.5 篩選并驗證40
• 3.3 實驗結果40-43
• 3.3.1 質粒完整性驗證結果40-41
• 3.3.2 雙酶切 pGEX-2T 及南極磷蝦胰蛋白酶 cDNA41-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 結論44-45
• 第四部分 融合蛋白的表達、鑒定與純化45-55
• 4.1 實驗材料45-47
• 4.1.1 菌株45
• 4.1.2 試劑45-47
• 4.1.3 主要儀器47
• 4.2 實驗方法47-51
• 4.2.1 表達47-49
• 4.2.2 優(yōu)化表達條件49
• 4.2.3 純化49-50
• 4.2.4 測定酶活性50-51
• 4.3 實驗結果51-54
• 4.3.1 初步表達的 SDS-PAGE 分析51-52
• 4.3.2 優(yōu)化條件表達的 SDS-PAGE 分析52-53
• 4.3.3 Glutathione Sepharose 4B 純化后的 SDS-PAGE 分析53
• 4.3.4 蛋白純化前后的蛋白濃度測定53-54
• 4.3.5 酶活力測定結果54
• 4.4 討論54
• 4.5 結論54-55
• 參考文獻55-58
• 綜述58-65
• 參考文獻63-65
• 攻讀學位期間已（待）發(fā)表的文章65-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前9條

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本文編號：712284