本文關(guān)鍵詞：單細(xì)胞檢測(cè)SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)染端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的表達(dá)及在監(jiān)測(cè)體外培養(yǎng)胚胎細(xì)胞中的應(yīng)用

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【摘要】：目的：構(gòu)建攜帶人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)的慢病毒表達(dá)載體,檢測(cè)hTERT基因在SKOV3細(xì)胞中的表達(dá)。方法：通過(guò)基因克隆構(gòu)建攜帶目的基因hTERT的重組慢病毒表達(dá)載體LV4-pGLV-EF1a-EGFP-hTERT,酶切、DNA測(cè)序驗(yàn)證插入片段hTERT的準(zhǔn)確性。慢病毒載體、包裝系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,超速離心沉淀法濃縮病毒上清,有限稀釋法測(cè)定病毒滴度。將重組慢病毒感染SKOV3細(xì)胞(SKOV3h),另外設(shè)立慢病毒空載體感染組(SKOV3b)和無(wú)處理組(SKOV3)為對(duì)照組,顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)、PCR驗(yàn)證hTERT mRNA表達(dá)、Western blot驗(yàn)證hTERT蛋白表達(dá)。結(jié)果：重組慢病毒LV4-pGLV-EFla-EGFP-hTERT與包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞能產(chǎn)生重組病毒;目的基因hTERT能被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá),熒光顯微鏡下可直接觀察到GFP; PCR、Western blot檢測(cè)感染后的SKOV3細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)hTERT基因mRNA、蛋白表達(dá)均增強(qiáng)。結(jié)論：成功構(gòu)建了慢病毒表達(dá)載體LV4-pGLV-EFla-EGFP-hTERT,其能將外源hTERT基因?qū)隨KOV3細(xì)胞并使其長(zhǎng)久表達(dá),為永生化研究奠定了科研基礎(chǔ)。 目的：初步建立單細(xì)胞PCR檢測(cè)基因表達(dá)的方法,探討通過(guò)該方法檢測(cè)SKOV3細(xì)胞和體外培養(yǎng)胚胎細(xì)胞hTERT基因mRNA的表達(dá)。方法：1.通過(guò)細(xì)胞數(shù)目、模板、引物等條件優(yōu)化建立最佳的單細(xì)胞PCR檢測(cè)基因表達(dá)的方法。2.實(shí)驗(yàn)分為三組,即通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定高表達(dá)hTERT蛋白的細(xì)胞株(SKOV3h),空載體感染組(SKOV3b)和未處理組(SKOV3),通過(guò)優(yōu)化的方法PCR檢測(cè)三組細(xì)胞hTERT基因mRNA的表達(dá)。3.實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)單個(gè)卵裂球hTERT基因的表達(dá)。結(jié)果：初步摸索的細(xì)胞數(shù)在50個(gè)以內(nèi),且隨著細(xì)胞數(shù)目的增多Ct (Cycle threshold)值逐漸增大(P0.05),最佳細(xì)胞數(shù)目為5個(gè)；模板3μL,引物0.2μL時(shí)PCR所得結(jié)果最佳；按最佳單細(xì)胞PCR條件測(cè)得SKOV3h組hTERT基因mRNA表達(dá)最高,SKOV3b組次之,SKOV3組表達(dá)最低(P0.05)；單個(gè)卵裂球可以有效檢測(cè)到hTERT基因mRNA表達(dá)。結(jié)論：SKOV3細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)hTERT基因后可促進(jìn)該基因的mRNA表達(dá),提示單細(xì)胞檢測(cè)基因表達(dá)有一定的靈敏度；單卵裂球檢測(cè)到基因表達(dá)為利用單細(xì)胞單基因遺傳學(xué)診斷及腫瘤學(xué)研究提供基礎(chǔ)。 單細(xì)胞PCR出現(xiàn)于上世紀(jì)80年代后期,開(kāi)創(chuàng)了單細(xì)胞基因表達(dá)的先河,它為在生命的基本單位——單細(xì)胞水平上進(jìn)行產(chǎn)前診斷、基因表達(dá)與DNA測(cè)序等領(lǐng)域的研究提供了簡(jiǎn)便又快捷的方法。二十多年來(lái),該技術(shù)不斷改進(jìn),從最初的神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)展到免疫研究、胚胎移植等領(lǐng)域。隨著時(shí)代的進(jìn)步,單細(xì)胞PCR在生命科學(xué)研究中將發(fā)揮更大的作用。
【關(guān)鍵詞】：基因克隆 慢病毒 hTERT 端粒酶 單細(xì)胞 PCR hTERT 流式細(xì)胞術(shù) 單細(xì)胞 RT-PCR 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 英文縮略詞6-8
• 摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 第一章 慢病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因hTERT在SKOV3中的表達(dá)17-73
• 1. 材料18-24
• 1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞18-19
• 1.2 主要設(shè)備及儀器19-20
• 1.3 主要試劑20-21
• 1.4 主要試劑配制21-23
• 1.5 引物設(shè)計(jì)23-24
• 2. 方法24-45
• 2.1 pGLV-EF1a-EGFP-hTERT慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建24-29
• 2.2 攜帶hTERT基因重組慢病毒的包裝、濃縮、感染29-34
• 2.3 重組慢病毒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT在靶細(xì)胞中的表達(dá)34-44
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理44-45
• 3. 結(jié)果45-65
• 3.1 重組慢病毒質(zhì)粒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT的鑒定45-60
• 3.2 包裝細(xì)胞293T轉(zhuǎn)導(dǎo)pGLV-EF1a-EGFP-hTERT后GFP的表達(dá)60
• 3.3 病毒滴度測(cè)定60-61
• 3.4 重組慢病毒pGLV-EF1a-EGFP-hTERT感染卵巢癌SKOV3細(xì)胞后GFP的表達(dá)61-62
• 3.5 重組慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞前后端粒酶基因hTERTmRNA的表達(dá)62-63
• 3.6 BCA法測(cè)定蛋白濃度63
• 3.7 重組慢病毒感染SKOV3細(xì)胞后hTERT蛋白表達(dá)情況63-65
• 4. 討論65-70
• 參考文獻(xiàn)70-73
• 第二章 單細(xì)胞PCR檢測(cè)細(xì)胞中端粒酶hTERT基因表達(dá)方法的建立73-91
• 1. 材料74-76
• 1.1 細(xì)胞來(lái)源74
• 1.2 試劑與儀器74-76
• 1.3 引物設(shè)計(jì)與合成76
• 2. 方法76-81
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)76-77
• 2.2 單細(xì)胞PCR77-80
• 2.3 單卵裂球?qū)崟r(shí)PCR80-81
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理81
• 3. 結(jié)果81-86
• 3.1 細(xì)胞數(shù)目的確定81-82
• 3.2 引物與cDNA含量的確定82-83
• 3.3 兩步法所得結(jié)果83-84
• 3.4 一步法所得結(jié)果84
• 3.5 hTERT基因mRNA表達(dá)分析84-85
• 3.6 單卵裂球PCR體系優(yōu)化85-86
• 3.7 單卵裂球PCR結(jié)果86
• 4. 討論86-89
• 參考文獻(xiàn)89-91
• 綜述 單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展91-110
• 1. 單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)研究特點(diǎn)91-98
• 1.1 單細(xì)胞的獲得93-95
• 1.2 單細(xì)胞的裂解95-96
• 1.3 單細(xì)胞RT-PCR擴(kuò)增96-98
• 2. 單細(xì)胞RT-PCR技術(shù)的應(yīng)用98-102
• 2.1 在基因表達(dá)方面的應(yīng)用98-99
• 2.2 在植入前基因診斷方面的應(yīng)用99-101
• 2.3 在離子通道及受體方面的應(yīng)用101-102
• 3. 單細(xì)胞RT-PCR的未來(lái)發(fā)展前景102-104
• 參考文獻(xiàn)104-110
• 致謝110-112
• 攻讀學(xué)位期間參與的課題及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文112

【參考文獻(xiàn)】

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8 李國(guó)華,李之望,王士端,魏勁波,鄭先科;通過(guò)膜片鉗玻璃微電極內(nèi)插管進(jìn)行胞內(nèi)透析[J];生理學(xué)報(bào);2002年02期

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1 陳陵;hTERT調(diào)控相關(guān)miRNA的鑒定及功能研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

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本文編號(hào)：636373