本文關鍵詞：家蠅幼蟲抗菌肽defensin基因的克隆、表達、純化及抑菌、抑腫瘤活性研究

  更多相關文章： 防御素 生物信息學分析 基因克隆 原核表達 蛋白純化 羥基脲 細胞周期 細胞凋亡 SW480 SIHA HepG2

【摘要】：實驗目的 1.在實驗研究過程中我們對家蠅抗菌肽防御素(defensin)基因進行生物信息學的分析；并應用分子生物學方法從家蠅幼蟲體內提取抗菌肽防御素(defensin)基因，并對該基因進行克隆、表達與純化。 2.鑒定已純化的家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)部分對大腸桿菌E.coliK12D31的抑制作用；觀察抗菌肽防御素成熟肽(MD)對腫瘤細胞HepG2,SIHA,SW480和對人正常心肌細胞H9C2的抑制及殺傷作用；比較該防御素成熟肽(MD)與羥基脲分別對肝癌細胞HepG2的作用效果。 3.觀察家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)對肝癌細胞HepG2細胞周期的影響；觀察家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)對肝癌細胞HepG2細胞凋亡的影響；觀察家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽(MD)對肝癌細胞HepG2凋亡蛋白半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的影響，從而探究抗菌肽防御素成熟肽(MD)殺傷肝癌細胞HepG2的作用機制與原理。 實驗方法 我們對家蠅抗菌肽防御素(defensin)基因的主要特性進行生物信息學的分析。應用蛋白質分析專家系統(tǒng)（ExPASy）上的SOSUI、 ProtParam、HNN、TMHMM、MotifScan和NCBI上的ORF finder、Bcepred等生物信息學在線分析軟件進行分析，并結合DNAman、Gene Runner等生物信息學分析軟件進行分析、預測家蠅抗菌肽防御素defensin蛋白的可溶性及理化性質、翻譯后修飾位點、跨膜區(qū)、親（疏）水性、二級結構、三級結構及同源性分析，以及遺傳關系的比對等。 在Genbank中檢索家蠅defensin基因，根據其設計特異性引物，我們在家蠅幼蟲組織中提取RNA,并通過PCR聚合酶鏈反應擴增defensin基因成熟肽部分(Mature defensin, MD)，并將該基因與原核質粒表達載體pGEX-6P-1進行質粒重組，構建家蠅抗菌肽重組蛋白pGEX-6P-1/MD。通過雙酶切鑒定證明目的片段已穩(wěn)定融合到載體pGEX-6P-1中并將其轉化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，經25℃IPTG誘導在大腸桿菌E.Coli DH5ɑ中表達，用GST-Sefinose親和層析純化蛋白，表達產物經15%SDS-PAGE分析鑒定。 應用四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法求出不同濃度抗菌肽MD對SW480，SIHA，HepG2腫瘤細胞的抑制率及對人心肌細胞H9C2的抑制作用。用MTT法對不同濃度抗菌肽防御素作腫瘤細胞的生長曲線。采用MTT比色法分別求出不同濃度抗菌肽防御素與羥基脲對肝癌細胞HepG2的抑制率，依據藥物濃度和抑制率用SPSS軟件求出防御素和羥基脲的半數抑制率(median inhibitory concentration，IC50)和回歸方程。我們采用AnnexinV-Fitc-PI雙染凋亡檢測試劑盒檢測抗菌肽防御素MD，檢測它能否引起肝癌細胞HepG2的細胞凋亡。我們用流式細胞儀檢測抗菌肽防御素MD，觀察它對肝癌細胞HepG2細胞周期及凋亡的影響。本實驗室應用caspase-3檢測試劑盒與酶標測定儀檢測該蛋白caspase-3酶的活性。 實驗結果 我們通過生物信息學分析defensin蛋白由92個氨基酸組成，該蛋白的分子式為C435H670N126O124S9,它的分子質量單位為9.9374ku，計算它的等電點理論值為8.75，檢測波長280nm時的吸光度（A）值為0.637，半衰期為30h，該蛋白具有4個翻譯后修飾位點。家蠅防御素與其他三種蠅科昆蟲防御素同源性較近。 以家蠅幼蟲抗菌肽防御素成熟肽MD的cDNA為摸板進行擴增后獲得的堿基長度為142bp的defensin基因片段，本實驗成功構建重組質粒pGEX-6P-1/MD;之后菌液通過IPTG誘導后進行SDS-PAGE膠進行分析，實驗結果顯示了在大腸桿菌BL21（DE3）中防御素成熟肽MD基因片段高效表達，它的相對分子量（Mr）約30kDa。 本實驗抑菌實驗結果顯示家蠅幼蟲抗菌肽防御素對大腸桿菌E. coli K12D31有抑殺作用；我們用MTT法檢測顯示六種不同濃度（30μg/ml,60μg/ml,120μg/ml,360μg/ml,680μg/ml,1000μg/ml）抗菌肽防御素MD對SW480，SIHA，HepG2腫瘤細胞均有不同程度的抑制作用，實驗結果與正常對照組比較結果具有統(tǒng)計學意義(p0.05)；這六種不同濃度抗菌肽防御素對人心肌細胞H9C2均無較明顯抑制作用，其實驗結果與正常對照組相比較無統(tǒng)計學意義(p0.05)；三種腫瘤細胞SW480，SIHA，HepG2在不同濃度抗菌肽防御素MD作用下生長受到明顯抑制，，防御素濃度和作用時間對細胞的抑制作用呈劑量反應關系；經計算防御素與羥基脲的回歸方程分別為=-1.566+0.529x和=-2.342+0.597x，它們的IC50半數抑制率分別是909μg/ml和8416μg/ml，結果顯示兩者的IC50相差較大，那么表明防御素的細胞增殖抑制作用比羥基脲高。 用流式細胞儀檢測抗菌肽防御素MD對人肝癌細胞HepG2細胞周期的影響結果：結果顯示GI期與M期的細胞比例有所增加，而S期細胞比例反而下降。顯示結果中只有GI期和S期與PBS對照組相比具有統(tǒng)計學意義(p0.01)，說明抗菌肽防御素MD使HepG2細胞周期在GI期停滯致使S期DNA的合成受到抑制。SW480，SIHA，HepG2這幾種腫瘤細胞之間的增殖抑制率在不同濃度組抗菌肽防御素MD作用下均無統(tǒng)計學意義(p0.05)。抗菌肽防御素MD對HepG2細胞caspase-3含量的影響結果：防御素組caspase-3的含量高于PBS對照組，兩者比較差異具有統(tǒng)計學意義。 結論 通過生物信息學發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲抗菌肽防御素defensin基因具有其特定的結構，可能具有抗菌活性及其他生物學活性；家蠅抗菌肽融合蛋白pGEX-6P-1/MD被成功克隆和表達，證明這三種腫瘤細胞SW480，SIHA，HepG2都能被純化蛋白MD抑制殺傷，這為以后研發(fā)家蠅抗菌肽防御素類藥物提供了依據。 抗菌肽防御素MD能夠抑制大腸桿菌生長繁殖活性；SW480，SIHA，HepG2三種腫瘤細胞均能被抗菌肽MD所抑制，但正常人體心肌細胞H9C2不能被其抑制；抗菌肽防御素比羥基脲對HepG2細胞具有更好的增殖抑制作用；SW480，SIHA，HepG2腫瘤細胞的抑制作用與抗菌肽MD呈劑量效應關系；將傳統(tǒng)抗腫瘤藥物與家蠅抗菌肽防御素MD比較，家蠅抗菌肽MD既能有效殺傷腫瘤細胞，又不損傷正常人體心肌細胞H9C2；家蠅抗菌肽MD可能通過兩種途徑發(fā)揮抑制腫瘤作用：肝癌細胞HepG2細胞周期受到抑制S期DNA的合成的影響；經線粒體途徑誘導肝癌細胞HepG2細胞凋亡。
【關鍵詞】：防御素 生物信息學分析 基因克隆 原核表達 蛋白純化 羥基脲 細胞周期 細胞凋亡 SW480 SIHA HepG2
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R384.2;Q78
【目錄】：

• 縮略詞6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 第一章 綜述17-31
• 參考文獻27-31
• 第二章 家蠅防御素 DEFENSIN 生物信息學分析31-43
• 摘要31
• Abstract31-32
• 材料與方法32-33
• 結果33-39
• 討論39-41
• 參考文獻41-43
• 第三章 家蠅幼蟲抗菌肽防御素基因的克隆原核表達、純化及抑菌、抑腫瘤活性鑒定43-66
• 摘要43
• Abstract43-44
• 前言44-45
• 材料與方法45-54
• 結果54-62
• 討論62-64
• 參考文獻64-66
• 第四章 家蠅幼蟲抗菌肽 MD 對 SW480，SIHA，HEPG2 等腫瘤細胞的抑制作用研究66-84
• 摘要66-67
• abstract67-69
• 前言69-70
• 材料與方法70-74
• 結果74-79
• 討論79-82
• 參考文獻82-84
• 附錄84-95
• 已發(fā)文章95-96
• 致謝96-97
• 個人簡歷97

【參考文獻】

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本文編號：630076