本文關(guān)鍵詞：酵母雙雜交技術(shù)篩選Cpn0147和Cpn0308配體的研究

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【摘要】：肺炎衣原體(Chlamydiapneumonia, Cpn)是一類嚴格的細胞內(nèi)生長并具有獨特的二相發(fā)育周期的病原微生物,主要引起呼吸道和肺部感染,并與心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)�，F(xiàn)有研究顯示部分衣原體基因編碼的分泌性蛋白以及包涵體膜蛋白(inclusion protein, Inc)在衣原體的一系列生命活動過程中扮演重要角色,其中Cpn0147與Cpn0308為已發(fā)現(xiàn)的衣原體包涵體膜蛋白,但其對衣原體生長發(fā)育的影響及與宿主細胞的相互作用機制尚不清楚。為此本研究構(gòu)建了HeLa細胞的酵母GAL4AD融合的cDNA文庫,應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)尋找Cpn0147, Cpn0308的配體蛋白,為進一步探討Cpn0147, Cpn0308的特性和可能的生物學(xué)作用提供了前瞻性研究。 首先,采用Trizol法從HeLa提取總的RNA,應(yīng)用SMARTTM技術(shù),以CDSⅢ、SMARTⅢ為引物,同時加入MMLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,在經(jīng)LD-PCR合成雙鏈cDNA后用CHROMA SPINTM+TE-400柱純化雙鏈cDNA,去除200bp以下的片段；將制備好的ds cDNA與pGAD T7-Rec、Herring Tests Carrier DNA(已變性)轉(zhuǎn)化到酵母Y187感受態(tài)細胞中進行同源重組,在SD/-Leu/Amp+平板上培養(yǎng)4d后,用冷凍培養(yǎng)基收集菌體,做菌落PCR檢測文庫多態(tài)性；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,PCR產(chǎn)物大小在0.3～3kb之間,顯示文庫具有良好的多態(tài)性。 然后從Cpn菌株AR39基因組中PCR擴增特異性片段Cpn0147, Cpn0308,經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamH Ⅰ雙酶切后克隆到誘餌載體pGBKT7中；經(jīng)菌落PCR、EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切初步驗證后,以pGBKT7載體上的T7引物作為測序引物進行堿基序列測定,測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析證實為Cpn0147, Cpn0308,將構(gòu)建成功的誘餌質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109和Y187,經(jīng)檢測無自激活和細胞毒性作用。 最后分別將誘餌基因pGBKT7-Cpn0147, pGBKT7-Cpn0308與HeLa細胞酵母GAL4AD融合cDNA文庫進行酵母雙雜交；用p-半乳糖苷酶印膜法、質(zhì)粒PCR進行篩選,并通過回交實驗進行驗證；對陽性質(zhì)粒進行堿基序列測定,經(jīng)BLASK比對檢測其同源蛋白,確定篩選基因。結(jié)果顯示,Cpn0147、Cpn0308與HeLa細胞cDNA文庫中多個基因的編碼產(chǎn)物發(fā)生了相互作用,其中CpnO147雜交結(jié)果包括脂肪酰輔酶A結(jié)合蛋白(ACBD3)、環(huán)腺苷酸應(yīng)答原件結(jié)合蛋白3(CREB3)、低密度脂受體相關(guān)蛋白11(LRP11)、離子通道相關(guān)蛋白(FXYD5)、真核翻譯延長因子1D(EEF1D)。Cpn0308雜交結(jié)果為脂肪酰輔酶A結(jié)合蛋白(ACBD3)。利用酵母雙雜交的方法初步成功篩選出與Cpn0147, Cpn0308相互作用的配體基因,為進一步研究其生物學(xué)功能打下了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：cDNA文庫 HeLa細胞 包涵體膜蛋白 誘餌載體 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 英文~.寫9-11
• 前言11-13
• 材料與方法13-28
• 結(jié)果28-32
• 附圖32-39
• 附表39-40
• 討論40-44
• 結(jié)論44-45
• 參考文獻45-51
• 綜述51-60
• 參考文獻56-60
• 致謝60-61
• 個人簡歷61

【參考文獻】

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本文編號：614864