本文關鍵詞：人冠狀病毒NL63受體結合區(qū)蛋白的原核表達純化與初步應用

  更多相關文章： HCoV-NL63 RBD 大腸桿菌 蛋白表達純化 疫苗 血清學檢測

【摘要】：人冠狀病毒NL63是有包膜的單股正鏈RNA病毒，系統(tǒng)分類學上屬于冠狀病毒ɑ組。棘突蛋白是病毒表面長的花瓣樣結構，在電子顯微鏡下形似王冠，是以三聚體形式存在的膜錨定的糖蛋白。S蛋白在病毒與細胞受體吸附、膜融合過程中發(fā)揮重要作用，同時介導不依賴補體的中和抗體的產(chǎn)生。經(jīng)研究，棘突蛋白是決定病毒組織嗜性和病毒毒力的主要因素。同其他冠狀病毒一樣，HCoV-NL63S蛋白可分為兩個亞結構域，分別是位于N端的包含受體結合區(qū)（Receptor bindingdomain,RBD）的S1區(qū)（21～717aa）；和位于C端的包含跨膜區(qū)（Transmembranedomain,TMD）的S2區(qū)（718～1356aa）。其中，S1區(qū)介導病毒與受體的識別和結合，，S2區(qū)則與細胞融合有關。對HCoV-NL63RBD的分析表明最基本的受體結合區(qū)域位于S1區(qū)中476～618aa（RS），但較大的受體結合區(qū)片段（RL，232～684aa）與人血管緊張素轉換酶（Human angiotensin-converting enzyme,hACE）2的結合能力明顯優(yōu)于RS。 本研究在E.coli系統(tǒng)中進行人冠狀病毒NL63受體結合區(qū)（RBD）大、小蛋白的表達純化，進行免疫學鑒定，將重組蛋白用于測定HCoV-NL63基因工程疫苗免疫小鼠后血清中的抗體滴度并將其用于檢測人群血清中的特異性抗體。 上述研究結果為深入研究HCoV-NL63感染流行規(guī)律、RBD的生物學功能及疫苗研發(fā)提供了基礎。 首先，利用本室前期密碼子優(yōu)化合成的HCoV-NL63S基因序列，設計受體結合區(qū)RBD(RL)（232～684aa）、RBD(RS)(476～616aa)蛋白編碼基因的特異性引物，并在5＇端與3＇端分別引入NcoI、XhoI酶切位點。利用PCR對片段進行擴增，酶切擴增片段以及表達載體pM48，連接轉化。挑取單克隆進行酶切鑒定并測序，成功獲得表達質(zhì)粒pM48-RS與pM48-RL。 將上述重組表達質(zhì)粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）plysS，經(jīng)過優(yōu)化表達條件，確定最佳誘導表達條件為37℃，0.8mM IPTG誘導4h時，蛋白表達量達到最高，融合蛋白主要以包涵體形式表達。 將上述重組蛋白超聲后收集的沉淀溶解在6M鹽酸胍中，進行親和層析后獲得純化的RS與RL融合蛋白，經(jīng)分析，蛋白純度大于95%。Western blot顯示，兩個融合蛋白均與痘苗病毒（天壇株）表達的相應蛋白免疫的小鼠血清發(fā)生特異性反應。 將純化的重組蛋白RS與RL應用于HCoV-NL63基因工程疫苗免疫小鼠后血清中的抗體滴度的測定，檢測結果顯示，質(zhì)粒免疫和痘苗病毒聯(lián)合免疫后小鼠血清中的抗體水平比單獨質(zhì)粒免疫后小鼠血清中的抗體水平高。 將融合蛋白作為檢測抗原，我們建立了WBLA(Western Blotting Line Assay)檢測方法，并用該方法檢測了30份正常成人血清中人冠狀病毒NL63特異性抗體，30份血清中，用RL檢出18份陽性血清，檢出率為60%；RS檢出18份陽性血清，檢出率為60%；IFA檢出18份陽性血清，檢出率為60%�；赗L與RS的WBLA檢測符合率為79.15%；基于RL的WBLA及基于RS的WBLA與IFA的符合率為58.33%。并應用重組蛋白作為包被抗原為間接ELISA檢測方法的建立做了初步探索。
【關鍵詞】：HCoV-NL63 RBD 大腸桿菌 蛋白表達純化 疫苗 血清學檢測
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R373;Q78
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-13
• 技術路線13-14
• 材料與方法14-32
• 實驗結果32-50
• 第一部分 人冠狀病毒 NL63 受體結合區(qū)蛋白的表達純化與鑒定32-41
• 1 HCoV-NL63 RS 與 RL 蛋白基因的合成及表達載體構建與鑒定32-34
• 1.1 HCoV-NL63 RBD(L) 蛋白基因的合成及密碼子優(yōu)化32
• 1.2 HCoV-NL63 RBD(L) 、RBD(S)蛋白基因的克隆32-33
• 1.3 重組表達質(zhì)粒 pM48-RS 和 pM48-RL 的構建33-34
• 1.4 重組表達質(zhì)粒 pM48-RS 和 pM48-RL 的鑒定34
• 2 HCoV-NL63 RS 與 RL 融合蛋白表達條件優(yōu)化與確定34-37
• 2.1 表達菌株的篩選34-36
• 2.2 RS 與 RL 蛋白表達形式及最佳誘導表達條件的確定36-37
• 3 HCoV-NL63 RS 與 RL 融合蛋白的純化研究37-39
• 3.1 重組融合蛋白 RS 的純化37-38
• 3.2 重組融合蛋白 RL 的純化38-39
• 3.3 重組融合蛋白產(chǎn)率的初步計算39
• 4 HCoV-NL63 RS 與 RL 融合蛋白的 WB 鑒定39-41
• 第二部分 重組 RBD 蛋白用于 HCoV-NL63 基因工程疫苗免疫小鼠后抗體的檢測41-43
• 1 抗原最佳包被濃度的確定41
• 2 交叉反應的確定41-42
• 3 測定小鼠血清中特異性抗體滴度42-43
• 第三部分 重組 RBD 蛋白用于 HCoV-NL63 感染人群抗體檢測43-50
• 1 WBLA(Western Blotting Line Assay)方法的建立及與 IFA 方法檢測結果的比較43-48
• 1.1 WBLA 方法的建立43-44
• 1.2 基于 RL 或 RS 蛋白的 WBLA 靈敏度檢測44
• 1.3 WBLA 檢測人群中特異性抗體44-48
• 2 ELISA 方法的初步探索48-50
• 討論50-53
• 全文小結53-54
• 參考文獻54-57
• 綜述57-65
• 參考文獻61-65
• 作者簡介65-66
• 致謝66

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 趙國霞;周為民;陸柔劍;王惠娟;趙敏;張庭瑛;鄧瑤;高基民;譚文杰;;表達人冠狀病毒NL63棘突蛋白不同片段的重組痘苗病毒的制備與表達分析[J];病毒學報;2011年03期

2 周為民;張陵林;陸柔劍;王慧娟;譚文杰;阮力;;人冠狀病毒NL63核殼蛋白和棘突蛋白的表達及其在血清學檢測中的初步應用[J];生物技術通訊;2010年02期

3 趙國霞;高基民;譚文杰;;人冠狀病毒NL63棘突蛋白的研究進展[J];生物技術通訊;2010年06期

本文編號：607568