本文關鍵詞：雙功能酶SpoT調控幽門螺桿菌適應克拉霉素壓力機制研究

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【摘要】：目的 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori, Hp)是一種具有極生鞭毛的革蘭氏陰性菌,生存于人類胃黏膜表面,人類大多數(shù)在兒童早期即感染Hp,且終生攜帶。研究表明,Hp感染是胃炎胃潰瘍發(fā)生發(fā)展的重要誘因,同時也是引起胃癌及胃黏膜相關組織淋巴瘤的關鍵危險因子。因此,1994年,Hp被世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構列為Ⅰ級致癌原,因而Hp感染的治療和根除成為亟需解決的科學問題。 Hp是否完全清除與根治,直接影響上述疾病的轉歸,目前臨床上治療多采用在膠體鉍劑或質子泵抑制劑的基礎上加兩種抗生素的三聯(lián)療法,克拉霉素(Clarithromycin,CLR)是新一代的大環(huán)內酯類抗生素,因其易吸收,對胃酸穩(wěn)定,因此是治療幽門螺桿菌三聯(lián)療法常用的抗生素之一。最新的馬特里共識已經(jīng)將以CLR為首的三聯(lián)療法列為根除幽門螺桿菌的首選療法。但是近年來由于CLR的過量和反復使用,Hp對CLR的耐藥率國內外均呈上升趨勢。目前對CLR耐藥機制的研究主要集中在對Hp23s rRNA基因點突變的分析上。但近幾年的研究發(fā)現(xiàn),許多Hp耐藥菌株的23s rRNA的基因并未發(fā)生突變,暗示23s rRNA突變并不是產生CLR耐藥的唯一因素,耐藥機制有待于進一步研究,以達到對CLR的合理使用。 SpoT,最早發(fā)現(xiàn)其功能為調控大腸桿菌的嚴謹應答。細菌在各種不利環(huán)境下發(fā)生的基因表達模式的改變統(tǒng)稱為嚴謹應答。調控嚴謹應答的是一個小的信號分子,稱作四磷酸鳥苷((p)ppGpp)。在不利環(huán)境下,大量積累的(p)ppGpp可以與RNA聚合酶結合從而改變啟動子的特嚩性和轉錄效率進而影響參與細菌生存力及抗壓相關基因的表達變化。在大腸桿菌中,(p)ppGpp是由RelA和SpoT兩種酶調節(jié)產生的,而在幽門螺桿菌中僅含有SpoT,且為雙功能酶,同時具有合成和水解(p)ppGpp的活性。有研究表明,(p)ppGpp參與糞腸球菌(Enterococcus faecalis)對萬古霉素的耐受調控過程,但(p)ppGpp是否參與Hp對CLR等抗生素的耐藥調控尚未有文獻報道。 研究表明,在革蘭氏陰性菌中,外膜通透性的降低及主動外排泵的活化是膜蛋白參與耐藥的主要貢獻。我們通過基因芯片預測發(fā)現(xiàn)多種膜蛋白在CLR刺激下mRNA的表達水平有明顯的變化,暗示膜蛋白在幽門螺桿菌抗CLR耐藥過程中可能發(fā)揮著重要作用,但具體機制尚未有人研究。 本研究主要探討Hp雙功能酶SpoT及其產物(p)ppGpp在CLR壓力環(huán)境下是否有調控作用；探索受SpoT調控的下游基因,為CLR耐受提供新的機制,為尋找新的藥物靶點和CLR在臨床的合理使用提供指導。 方法 1.同源重組法在Hp26695菌株中構建spoT缺失突變株("縮poT), kefB缺失突變株("縦efB)及spoT回復株(spoT*)。 2.瓊脂稀釋法判定CLR的最小抑菌濃度(MIC)。用含不同遞減濃度CLR的平板接種受試菌,孵育后觀察細菌生長情況,以抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。 3.檢測雙功能酶SpoT及其產物(p)ppGpp在CLR存在的壓力環(huán)境下的表達變化。 (1)用最小抑菌濃度(MIC)的CLR刺激野生株Hp26695,對照組為同樣培養(yǎng)的野生株Hp26695(不加CLR刺激),1h后,分別提取兩組菌的RNA,并反轉錄為cDNA, Real-time PCR檢測spoT的表達。 (2)將Hp26695,"縮poT及spoT*用32p標記一代后,用MIC的CLR分別處理野生株Hp26695,"縮poT及spoT*,對照組為同樣培養(yǎng)的野生株Hp26695,"縮poT及spoT*(不加CLR處理),1h后,分別提取六組菌的核苷酸,薄層層析法檢測(p)ppGpp合成量的變化。 4.平板菌落計數(shù)法、MIC測定以及熒光染色法比較Hp26695,"縮poT及spoT*經(jīng)CLR處理后其生存率以及MIC的變化。 5.基因芯片比較Hp26695與"縮poT在CLR最小抑菌濃度下基因表達差異。將未經(jīng)CLR刺激的野生株及"縮poT株以及經(jīng)過CLR刺激1h后的野生株和"縮poT株分別做基因芯片檢測,通過四組數(shù)據(jù)比較找出CLR壓力下可能受SpoT調控的基因。 6Real-Time PCR法驗證基因芯片結果。將Hp26695,"縮poT及spoT*分別用CLR處理,對照組為同樣培養(yǎng)的三種菌(不加CLR處理),1h后,分別提取兩組菌的RNA,并反轉錄為cDNA,運用Real-time PCR檢測基因芯片篩選出的基因的表達。 7.檢測受SpoT調控的基因缺失突變后Hp耐受CLR能力的影響。通過平板菌落計數(shù)法、MIC測定以及熒光染色法比較野生株與缺失突變株經(jīng)CLR處理后生存率及MIC的變化。 結果 1.在野生株Hp26695上成功構建出spoT缺失突變株("縮poT), kefB缺失突變株("縦efB)以及在"縮poT中構建出spoT回復株(spoT*)。 2.CLR能夠引起Hp的嚴謹應答,SpoT及其產物(p)ppGpp參與Hp耐受CLR的調控過程。用0.125μg/mL的CLR處理Hp266951h后,與對照組相比,在mRNA水平,處理組基因spoT的表達顯著升高(P＜0.05)；用32p標記的Hp26695株,"縮poT株及spoT*株經(jīng)0.125μg/mL的CLR處理后發(fā)現(xiàn),與對照組相比,Hp26695株及spoT*株的(p)ppGpp的合成量均有明顯的增高,而對于"縮poT株,處理前后未見(p)ppGpp合成。 3SpoT在耐受CLR過程中確實發(fā)揮重要作用。為進一步證明SpoT參與Hp耐受CLR的調控過程,我們通過平板菌落計數(shù)法、MIC測定以及熒光染色的方法比較Hp26695,"縮poT及spoT*經(jīng)CLR處理以后其生存率以及MIC的變化發(fā)現(xiàn),用5MIC的CLR分別處理三種菌,"縮poT的生存率在處理2h時即降到1%以下,而Hp26695及spoT*在處理8h后其生存率仍在10%以上；熒光染色結果顯示,5MIC的CLR處理后,"縮poT的存活率較野生株及回復株明顯降低；同樣,通過對三種菌株的MIC檢測發(fā)現(xiàn),"縮poT的MIC較野生株及回復株降低了50%左右。 4.多種膜蛋白參與Hp適應CLR壓力過程。將未經(jīng)CLR刺激的野生株Hp26695和"縮poT株以及經(jīng)過CLR刺激1h后的野生株不(?)"縮poT的基因芯片結果比較得出,在0.125μg/mL的CLR的刺激下,野生株Hp26695中約有221個基因表達發(fā)生顯著的變化(Fold≥3),其中占比例最高的是膜蛋白,占24%,在膜蛋白基因中有13個基因在野生株Hp26695上有顯著變化,而在"縮poT菌株中CLR處理前后基因的表達無顯著變化。 5.受SpoT調控的質子泵KefB參與Hp適應CLR過程。用Real-Time PCR的方法驗證芯片預測可能受SpoT調控的基因,發(fā)現(xiàn)只有質子泵基因kefB在Hp26695經(jīng)CLR處理后表達量明顯上調(P＜0.05),而在將spoT敲除的菌株中,經(jīng)CLR處理前后kefB表達量無明顯變化,將spoT基因回復以后,kefB的表達量又有顯著上調(P＜0.05)。 6KefB參與Hp耐受CLR過程。為進一步證明質子泵KefB參與Hp適應CLR過程,我們構建了kefB缺失突變株并通過平板菌落計數(shù)法、MIC測定以及熒光染色法比較Hp26695,"縦efB經(jīng)CLR處理后生存率以及MIC的變化。發(fā)現(xiàn),用5MIC的CLR分別處理兩種菌,"縦efB在處理4h后存活率即降到1%以下,而Hp26695與前面結果一致,處理8h后其存活率仍在10%以上；熒光染色結果顯示,5MIC的CLR處理后,"縦efB的存活率較野生株明顯降低；同樣,通過對兩種菌株的MIC檢測發(fā)現(xiàn),"縦efB的MIC較野生株下降了25%。 結論 雙功能酶SpoT及其產物(p)ppGpp在Hp適應CLR過程中發(fā)揮重要的調控作用,能夠調控下游質子泵KefB的高表達,使得細菌抵抗抗生素CLR的損害,最終使得Hp快速適應CLR環(huán)境,為進一步耐受應答、耐藥株產生奠定了時間基礎和物質基礎。
【關鍵詞】：幽門螺桿菌 克拉霉素 SpoT (p)ppGpp KefB
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-15
• 符號說明15-17
• 前言17-20
• 材料與方法20-37
• 1. 實驗材料20-26
• 2. 實驗方法26-37
• 實驗結果37-40
• 討論40-44
• 結論44-45
• 本研究未完成工作45-46
• 附圖表46-62
• 參考文獻62-67
• 致謝67-68
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文68-69
• 附件69

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1 姜葵;何利華;趙飛;王邦茂;張建中;;一種新的幽門螺桿菌克拉霉素耐藥相關基因[J];世界華人消化雜志;2006年15期

2 任貴香;劉學遜;;克拉霉素三聯(lián)療法根除幽門螺桿菌臨床觀察[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2009年09期

3 鄭云鵬;鄭鵬遠;劉志強;;幽門螺桿菌的耐藥性分析[J];鄭州大學學報(醫(yī)學版);2007年03期

4 白楊;張振書;;影響幽門螺桿菌根除與復發(fā)的因素[J];現(xiàn)代消化及介入診療;2005年04期

5 程書權;大環(huán)內酯類抗生素應用于非感染性疾病的某些新探索[J];國外醫(yī)藥.抗生素分冊;2004年05期

6 徐勝祁;徐向毅;;奧美拉唑、克拉霉素和阿莫西林治療十二指腸球部潰瘍的療效觀察[J];實用診斷與治療雜志;2005年12期

7 彭成靜;衛(wèi)東;阮鵬;;心理暗示對克拉霉素抗HP不良反應的影響[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2006年10期

8 溫晉鋒;陳春曉;;幽門螺桿菌克拉霉素耐藥的研究現(xiàn)狀[J];國際消化病雜志;2011年01期

9 宣世海;周玉貴;王惠民;;幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的研究進展[J];世界華人消化雜志;2008年27期

10 黃衍強;黃贊松;何勇強;趙麗娟;周喜漢;;桂西地區(qū)幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的調查[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2008年20期

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1 姜葵;何利華;王邦茂;劉文天;張建中;黃俠;;含克拉霉素標準三聯(lián)法根除幽門螺桿菌的臨床研究[A];中華醫(yī)學會第12次全國內科學術會議論文匯編[C];2009年

2 姜葵;王邦茂;劉文天;黃俠;;含左氧氟沙星三聯(lián)法作為一線方案根除幽門螺桿菌的臨床研究[A];中華醫(yī)學會第12次全國內科學術會議論文匯編[C];2009年

3 黃贊松;黃衍強;秦靜英;周喜漢;;桂西地區(qū)對克拉霉素耐藥的幽門螺桿菌基因分型研究[A];第九次全國消化系統(tǒng)疾病學術會議專題報告論文集[C];2009年

4 鄭小麗;胡伏蓮;王蔚虹;;克拉霉素耐藥的幽門螺桿菌耐藥性和基因型的同一性[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編（上冊）[C];2007年

5 姜葵;趙飛;肖迪;閆笑梅;顧一心;張建中;王邦茂;;26695野生株與實驗室不同濃度克拉霉素選擇壓力耐藥株2DE比較[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編（上冊）[C];2007年

6 姜葵;何利華;趙飛;張建中;王邦茂;;一種新的幽門螺桿菌克拉霉素耐藥相關基因[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編（上冊）[C];2007年

7 顧清;王虹;高建萍;何偉;周磊;孫一駿;顧而立;顧麗霞;董蕾;;對上海中心城區(qū)幽門螺桿菌臨床分離菌株原發(fā)性耐藥的調查[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編（上冊）[C];2007年

8 張孝平;王蔚虹;田雨;高文;李江;胡伏蓮;;阿司匹林影響幽門螺桿菌外膜對抗生素的通透性[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編（上冊）[C];2007年

9 劉錄恒;姚創(chuàng)利;;幽門螺桿菌的分離培養(yǎng)和體外抗菌活性研究[A];第九屆西北五省（區(qū)）檢驗醫(yī)學學術會議論文匯編[C];2005年

10 王平;周力;張永宏;;幽門螺桿菌的研究現(xiàn)狀[A];2006年貴州省醫(yī)學會消化及內鏡學分會學術大會論文匯編[C];2006年

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1 李鑫;幽門螺桿菌——胃內的隱形殺手[N];中國醫(yī)藥報;2010年

2 蔡德山;克拉霉素市場波瀾不驚[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2004年

3 廣東省連州市北湖醫(yī)院副主任醫(yī)師 陳金偉;耐青霉素肺炎可用克拉霉素[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2011年

4 王立峰;諸強鼎立 前景看好[N];中國醫(yī)藥報;2003年

5 文/徐天景（副主任醫(yī)師）;可惡的幽門螺桿菌[N];上海中醫(yī)藥報;2002年

6 武和平;幽門螺桿菌是如何傳播的[N];文匯報;2003年

7 記者李天舒;幽門螺桿菌被西蘭花“打敗”[N];健康報;2009年

8 記者 于菲;三招除幽門螺桿菌[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報;2009年

9 任海軍;西藍花嫩芽抑制幽門螺桿菌[N];中國中醫(yī)藥報;2009年

10 香港麥迪信醫(yī)學出版有限公司供稿;拯救幽門螺桿菌！[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

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1 郝慶;幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥的分子基礎[D];中國醫(yī)科大學;2002年

2 劉爽;幽門螺桿菌σ~（54）調節(jié)穩(wěn)定期細菌存活及硫代蒜素抗菌的機制研究[D];山東大學;2010年

3 劉有恃;幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性及其機理的研究[D];浙江大學;2006年

4 袁文臻;抗幽門螺桿菌治療對糾正H.pylori陽性患者缺鐵性貧血的系統(tǒng)評價[D];蘭州大學;2010年

5 鮑峻峻;抗幽門螺桿菌抗菌藥左氧氟沙星經(jīng)胃和膽汁轉運、分布特點的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2009年

6 趙英會;IFN-γ對幽門螺桿菌和胃黏膜細胞作用及其機制的初步探討[D];山東大學;2011年

7 柏長青;克拉霉素抗腫瘤血管生成的實驗研究[D];第四軍醫(yī)大學;2002年

8 王廣;幽門螺桿菌熱休克蛋白60與冠狀動脈粥樣硬化關系的研究[D];吉林大學;2010年

9 宋春芳;幽門螺桿菌相關性胃疾病凋亡特性及其調控機制的研究[D];中國醫(yī)科大學;2003年

10 張磊;CYP2C19和IL-1基因多態(tài)性對PPIs治療消化性潰瘍的影響及雷貝拉唑肝腸首過效應的初步研究[D];安徽醫(yī)科大學;2009年

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1 余金丹;兒童感染幽門螺桿菌對克拉霉素耐藥性及耐藥機制的研究[D];浙江大學;2004年

2 鄭云鵬;幽門螺桿菌的耐藥性研究[D];鄭州大學;2007年

3 李雯;雙功能酶SpoT調控幽門螺桿菌適應克拉霉素壓力機制研究[D];山東大學;2013年

4 陸志瑛;1500例上消化道疾病患者幽門螺桿菌耐藥率分析[D];浙江大學;2008年

5 張孝平;阿司匹林增加幽門螺桿菌對抗生素敏感性的機制[D];北京大學;2008年

6 陳靜園;幽門螺桿菌ArsRS信號標簽突變體的構建及STM文庫構建方法的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

7 李芳;山西省呂梁市幽門螺桿菌耐藥性的研究[D];山西醫(yī)科大學;2007年

8 晁園;含莫西沙星的PPI三聯(lián)療法對幽門螺桿菌根除的隨機、平行對照臨床研究[D];浙江大學;2009年

9 梁小燕;國產埃索美拉唑腸溶膠囊治療十二指腸潰瘍隨機、雙盲、平行對照研究[D];重慶醫(yī)科大學;2007年

10 于晗;幽門螺桿菌甲硝唑耐藥的比較蛋白質組學初步研究[D];山東大學;2009年

，

本文編號：569442