發(fā)布時間：2017-07-20 13:00

  本文關鍵詞：日本血吸蟲重組Bb（pGEX-Sj26GST-Sj32）疫苗的構建及免疫應答的動態(tài)觀察

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【摘要】：目的 日本血吸蟲病是由日本血吸蟲（Schistosoma japonicum, Sj）引起的一種危害人體健康的地方性人獸共患寄生蟲病。由于該病危害大，因此研發(fā)有效的疫苗防治該病已是勢在必行。本研究擬構建Sj重組兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum，Bb)(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，并研究其免疫BALB/c小鼠后免疫應答的動態(tài)變化，以期為Sj的免疫預防提供一條新途徑。 方法 從我室保存的BL21(DE3)(pET28α-Sj26GST-Sj32)重組菌中抽提質粒pET28α-Sj26GST-Sj32，PCR擴增Sj26GST-Sj32融合基因，將該融合基因定向克隆到大腸埃希菌-雙歧桿菌穿梭表達載體pGEX-1λT中，構建重組質粒pGEX-Sj26GST-Sj32。將該重組質粒轉化至大腸埃希菌BL21感受態(tài)細胞中，抽提質粒并進行雙酶切，鑒定載體片段及目的基因片段長度。用電穿孔法將重組質粒pGEX-Sj26GST-Sj32轉化至Bb，構建Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗，抽提質粒進行PCR鑒定。將重組質粒轉化大腸埃希菌BL21，經(jīng)IPTG誘導后以SDS-PAGE及Western-blot對表達產(chǎn)物進行鑒定。 將96只BALB/c小鼠隨機分為2組，每組48只，用重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗分別經(jīng)口服灌胃和鼻腔粘膜兩種途徑免疫小鼠，在免疫后0～22周每兩周兩組分別剖殺4只小鼠，分離血清，ELISA法測定血清抗體及細胞因子；取脾并分離脾細胞，用Sj成蟲抗原（SjAWA抗原）和刀豆蛋白A（ConA）刺激培養(yǎng)，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測免疫小鼠脾細胞增殖反應，同時設原液組對照；用流式細胞術（FCM）檢測免疫小鼠脾CD4+和CD8+T細胞亞群的百分比；脾細胞經(jīng)SjAWA抗原及ConA刺激培養(yǎng)，收集培養(yǎng)的上清液，雙抗體夾心ELISA法檢測脾細胞培養(yǎng)上清液的IL-10及IL-12水平，，設原液組（stock group）作為對照；脾細胞經(jīng)ConA培養(yǎng)，流式細胞儀檢測脾細胞的凋亡發(fā)生率，并設原液組作為對照。 結果 PCR成功擴增出長度為1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；雙酶切證實Sj26GST-Sj32融合基因成功插入質粒pGEX-1λT中；PCR證實從重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗中擴增出1991bp的Sj26GST-Sj32融合基因；SDS-PAGE分析顯示將重組質粒pGEX-Sj26GST-Sj32在E.coli BL21中經(jīng)IPTG誘導表達后，得到分子量約85kDa的條帶，其中以5～7h處表達水平較高； Western-blot發(fā)現(xiàn)重組質粒pGEX-Sj26GST-Sj32表達產(chǎn)物可被Sj感染的兔血清識別。 口服免疫（per os，PO）組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別在免疫后6、8、8、4、6、12和6周達峰值；血清IL-10和IL-12水平分別在免疫后12、6周達峰值。鼻腔粘膜（intranasal，IN）組小鼠血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgE和IgA水平分別在免疫后4、2、6、2、4、8和8周達峰值；血清IL-10和IL-12水平分別于免疫后6周達峰值。PO組增殖水平于免疫后4w達高峰，而IN組于免疫后12w達高峰。PO組脾CD4+T細胞亞群于免疫后4w達最高水平，IN組CD4+T細胞亞群于免疫后12w達最高水平；PO組脾CD8+T細胞亞群于10w達峰值，IN組CD8+T細胞亞群于免疫后6w達最高水平。PO組和IN組小鼠脾細胞IL-10水平均于免疫后6w達最高；PO組小鼠脾細胞IL-12水平于免疫后6w達最高，IN組脾細胞IL-12水平于12w達最高水平。PO組小鼠脾細胞凋亡率于免疫后6w達最高，而IN組脾細胞凋亡率于12w達最高水平。 結論 成功構建日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗；該疫苗在免疫早期可誘導小鼠產(chǎn)生有效地Th1和Th2型混合性免疫應答。
【關鍵詞】：日本血吸蟲 重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗 構建 免疫應答 動態(tài)觀察
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R392
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-18
• 參考文獻17-18
• 第一章 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗構建及其表達效率18-32
• 第一節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗的構建及鑒定18-27
• 1 材料與方法18-21
• 2 結果21-23
• 3 討論23-25
• 參考文獻25-27
• 第二節(jié) 日本血吸蟲重組質粒 pGEX-Sj26GST-Sj32 在大腸埃希菌 BL21(DE3)表達效率的研究27-32
• 1 材料和方法27-28
• 2 結果28-30
• 3 討論30
• 參考文獻30-32
• 第二章 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗誘導BALB/c鼠免疫應答的動態(tài)觀察32-62
• 第一節(jié) 日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫BALB/c鼠血清抗體及細胞因子的動態(tài)觀察32-42
• 1 材料與方法32-33
• 2 結果33-36
• 3 討論36-39
• 參考文獻39-42
• 第二節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細胞增殖的動態(tài)觀察42-47
• 1 材料與方法42-43
• 2 結果43-45
• 3 討論45
• 參考文獻45-47
• 第三節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細胞亞群的動態(tài)觀察47-52
• 1 材料與方法47-48
• 2 結果48-49
• 3 討論49-51
• 參考文獻51-52
• 第四節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細胞因子動態(tài)觀察52-57
• 1 材料與方法52-53
• 2 結果53-55
• 3 討論55-56
• 參考文獻56-57
• 第五節(jié) 日本血吸蟲重組 Bb(pGEX-Sj26GST-Sj32)疫苗免疫小鼠后脾細胞凋亡的動態(tài)觀察57-62
• 1 材料與方法57-58
• 2 結果58-59
• 3 討論59-60
• 參考文獻60-62
• 全文小結62-63
• 文獻綜述63-71
• 參考文獻68-71
• 致謝71-72
• 攻讀學位期間發(fā)表的論文72-73

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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8 趙晶晶;黃俊;麥t熡

本文編號：568079