本文關(guān)鍵詞：小鼠諾如病毒檢測方法的研究

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【摘要】：實(shí)驗(yàn)動物的質(zhì)量與動物實(shí)驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行關(guān)系非常密切,我國要求實(shí)驗(yàn)用SPF級小鼠必須排除的病毒有11種,盡管如此仍然會因?yàn)閯游锉旧頂y帶的微生物而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。小鼠諾如病毒(Murine Norovirus, MNV)就是從意外死亡的實(shí)驗(yàn)小鼠中分離得到,免疫缺陷小鼠感染這種病毒后發(fā)生炎癥反應(yīng)甚至死亡。我國關(guān)于小鼠諾如病毒的報(bào)道還比較少,其致病力及對實(shí)驗(yàn)研究的影響尚不完全清楚,也沒有明確的感染情況調(diào)查。 本研究以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高效的MNV檢測為目的,分別建立了MNV檢測的PCR方法,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法,間接免疫熒光試驗(yàn)法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法,并對北京市實(shí)驗(yàn)小鼠MNV感染情況進(jìn)行調(diào)查,具體工作如下： 1、MNV標(biāo)準(zhǔn)化檢測技術(shù)的建立 (1)一步法RT-PCR方法：通過對MNV全基因組序列分析,設(shè)計(jì)最適的擴(kuò)增引物并對其優(yōu)化,對反應(yīng)體系及反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化,使體系的靈敏度最優(yōu)化,最終確定反應(yīng)體系為引物濃度0.3μmol/L, Mg2+濃度1.5mmol/L時(shí),該方法的靈敏度可達(dá)到103拷貝；(2)兩步法實(shí)時(shí)熒光定量qPCR方法：優(yōu)化并評價(jià)了反應(yīng)條件,最終確定反應(yīng)體系中引物濃度0.3μmol/L,探針濃度03μmo1/L,以Ct值為35作為檢測限,該方法的靈敏度可達(dá)到幾個(gè)拷貝數(shù)；(3)間接免疫熒光分析方法：以全病毒作為抗原。嚴(yán)格控制抗原玻片的陽性細(xì)胞量,優(yōu)化抗原玻片制作過程,該方法檢測的80份血清中,IFA法測定陽性27份,陰性53份,檢測符合率為96.0%；(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法：以重組蛋白VP1為抗原,棋盤法確定抗原濃度和待檢血清最佳稀釋度,其靈敏度高于商品化的ELISA試劑盒且與其他抗原之間無交叉反應(yīng)。 2、北京市實(shí)驗(yàn)小鼠MNV感染情況調(diào)查。 本研究隨機(jī)選擇了2007年-2013年中的600份來自不同設(shè)施的實(shí)驗(yàn)小鼠血清,分別采用間接免疫熒光分析方法和建立了酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法對其進(jìn)行檢測,基于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,這六年中不同年份的不同實(shí)驗(yàn)設(shè)施中均檢出實(shí)驗(yàn)小鼠感染MNV的情況,此外,大多數(shù)MNV陽性樣本來自實(shí)驗(yàn)設(shè)施(69/223)。動物供應(yīng)商提供的樣品中僅有1例檢測為MNV陽性(1/377)�；诋�(dāng)前分析,MNV在北京地區(qū)的實(shí)驗(yàn)設(shè)施實(shí)驗(yàn)小鼠中的感染率較高。
【關(guān)鍵詞】：小鼠諾如病毒 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 免疫熒光試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R373
【目錄】：

• 中文摘要4-5
• Abstract5-7
• 第一部分 前言7-16
• 1.1 病原學(xué)7-8
• 1.2 分子生物學(xué)8-10
• 1.3 檢測方法10-12
• 1.4 預(yù)防和控制12-13
• 1.5 本論文的研究目的及意義13-14
• 1.6 前景與展望14-16
• 第二部分 材料與方法16-29
• 2.1 材料16-20
• 2.2 方法20-29
• 第三部分 研究結(jié)果29-47
• 3.1 RNA抽提方法的優(yōu)化29-31
• 3.2 一步法RT-PCR反應(yīng)體系體系的優(yōu)化31-33
• 3.3 兩步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR的建立及優(yōu)化33-34
• 3.4 IFA方法的建立及優(yōu)化34-40
• 3.5 ELISA方法的建立及優(yōu)化40-44
• 3.6 北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)小鼠感染MNV情況的調(diào)查結(jié)果44-47
• 第四部分 討論47-50
• 第五部分 小結(jié)50-51
• 參考文獻(xiàn)51-57
• 附錄1：小鼠諾如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)玻片抗原制備作業(yè)指導(dǎo)書57-60
• 附錄2：小鼠諾如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)免疫熒光法檢測作業(yè)指導(dǎo)書60-63
• 附錄3：小鼠諾如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)酶聯(lián)免疫吸附法檢測作業(yè)指導(dǎo)書63-66
• 附錄4：小鼠諾如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)RNA一步法RT-PCR檢測作業(yè)指導(dǎo)書66-69
• 附錄5：小鼠諾如病毒(Murine Norovirus Virus,MNV)cDNA Real-Time qPCR檢測作業(yè)指導(dǎo)書69-71
• 附錄6：英文縮寫71-72
• 致謝72-73

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 田勝男;劉云波;;鼠諾如病毒概述[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2013年07期

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本文編號：545896