本文關鍵詞：恥垢分枝桿菌ligD和ku突變株的構建

  更多相關文章： 恥垢分枝桿菌 非同源末端連接 Ku LigD 突變株

【摘要】：結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)可引起結核病,是微生物中人類最大的敵人,據世界衛(wèi)生組織預測全球三分之一的人口感染了MTB, WHO的數據顯示,2011年全球新發(fā)現有870萬感染者患病,其中有110萬患者同時感染艾滋病毒,估計有140萬人死于結核病。因與艾滋病毒共同感染人體造成死亡的數目之巨,MTB已成為傳染病中的頭號殺手。雖然現已開發(fā)幾種抗結核類藥物但由于耐藥性的產生,這些藥物的控制效果遠遠達不到令人滿意的效果。結核病是一個從未解決的麻煩。 DNA雙鏈斷裂是普遍存在的一種DNA損傷,但其對于細胞來說是致命的。修復DNA雙鏈斷裂的途徑有同源重組(homologous recombination, HR)和非同源末端連接(non-homologous end-joining, NHEJ)。NHEJ最早是在哺乳動物細胞中發(fā)現的,并一直被認為只存在于真核生物中,其在真核生物中對保持基因組的穩(wěn)定性有很重要的作用。但之后的研究發(fā)現NHEJ也普遍存在于一些病原微生物中,且與耐藥和免疫逃避相關。 現已知NHEJ修復途徑涉及兩個蛋白LigD和Ku,同時對這兩個蛋白的功能也有了一定的了解,而在NHEJ修復過程中,LigD同Ku的作用機制及調控方式還不是很明確。本實驗室前期研究發(fā)現去乙酰化酶Sir2可能參與NHEJ修復途徑,還發(fā)現Ku的29位賴氨酸有乙�；揎�,這暗示了NHEJ修復的調控可能同Ku的K29乙酰化修飾有關。 我們以恥垢分枝桿菌做為模式生物使用無標記基因敲除法來構建ligD和ku兩個基因的不同突變體ligD ΔPolDom、TBku-his、ku-his、kuR29-his和kuQ29-his。無標記基因敲除需要兩個質粒,一個質粒為p1NIL,為目的基因提供多克隆位點,第二個質粒pGOAL,含有一個兩端為PacI酶切位點的標記基因盒。標記基因盒里有抗生素抗性基因、lacZ和sacB。構建成的自殺質粒含有pGOAL質粒的標記基因盒和修飾過的目的基因,最后經過兩次篩選得到我們所要的突變體。實驗結果發(fā)現同源臂的長度、堿處理質粒時堿的終濃度、沉淀DNA溶液的pH等條件和第二次篩選的擴增培養(yǎng)時間等都影響雙交換法突變株的構建。同時也發(fā)現M. smegmatis Ku的C端加His標簽不影響其參與的NHEJ活性,這為后面檢測恥垢分枝桿菌ku突變株(kuR29-his和kuQ29-his)的NHEJ活性時,消除His標簽引起NHEJ活性改變的影響。這些突變體為研究NHEJ修復的調控方式提供了重要的材料。
【關鍵詞】：恥垢分枝桿菌 非同源末端連接 Ku LigD 突變株
【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911
【目錄】：

• 目錄4-7
• 摘要7-8
• Abstract8-10
• 縮略語表10-11
• 1 前言11-29
• 1.1 結核分枝桿菌及其危害11-13
• 1.1.1 結核分枝桿菌11-12
• 1.1.2 結核分枝桿菌的危害12-13
• 1.2 結核分枝桿菌中的DNA修復13-15
• 1.3 真核生物的NHEJ15-18
• 1.3.1 真核中蛋白組成和互作16
• 1.3.2 真核NHEJ修復機制16-18
• 1.4 原核生物的NHEJ18-22
• 1.4.1 Ku蛋白19-20
• 1.4.2 LigD蛋白20-22
• 1.4.2.1 POL結構域21
• 1.4.2.2 LIG結構域21
• 1.4.2.3 PE結構域21-22
• 1.5 結核分枝桿菌中的NHEJ22-25
• 1.6 蛋白質的乙�；揎�25
• 1.7 基因敲除原理25-28
• 1.8 研究目的與意義28-29
• 2 材料和方法29-43
• 2.1 材料29-33
• 2.1.1 質粒與菌株29-30
• 2.1.2 培養(yǎng)基30
• 2.1.3 主要試劑30
• 2.1.4 主要溶液30-32
• 2.1.5 主要實驗儀器32-33
• 2.2 方法33-43
• 2.2.1 目的片斷的克隆33-36
• 2.2.1.1 構建pZY73質粒的目的基因片段33-34
• 2.2.1.2 構建pZY75質粒的目的基因片段34-35
• 2.2.1.3 構建pZY91質粒的目的基因片段35-36
• 2.2.2 電轉質粒的構建36-38
• 2.2.2.1 p1NIL與pGOAL質粒的制備36-37
• 2.2.2.2 p1NIL質粒的酶切37
• 2.2.2.3 目的片段與酶切后的p1NIL連接37
• 2.2.2.4 p1NIL-目的片段重組質粒的轉化37-38
• 2.2.2.5 PacⅠ酶切重組質粒與pGOAL質粒38
• 2.2.2.6 pGOAL質粒與p1NIL-target gene的連接38
• 2.2.2.7 電轉質粒載體的轉化38
• 2.2.3 基因敲除38-40
• 2.2.3.1 感受態(tài)的制備38-39
• 2.2.3.2 質粒的預處理39
• 2.2.3.3 電轉39-40
• 2.2.3.4 第二次篩選40
• 2.2.4 突變體陽性檢測40-43
• 2.2.4.1 PCR驗證第二次篩選40
• 2.2.4.2 Western Blot驗證40-41
• 2.2.4.3 M.smegmatis ku-his菌株中的Ku-His蛋白純化41-42
• 2.2.4.4 SDS-PAGE分析蛋白純度和分子量42
• 2.2.4.5 NHEJ效率檢測42-43
• 3 結果與分析43-51
• 3.1 目的片段的構建43-44
• 3.1.1 pZY73質粒的目的基因片段43
• 3.1.2 pZY75質粒的目的基因片段43-44
• 3.1.3 pZY91質粒的目的基因片段44
• 3.2 p1NIL與pGOAL質粒的酶切44-45
• 3.3 pZY73、pZY75與pZY91質粒酶切驗證45-46
• 3.4 堿處理的條件46-47
• 3.5 第二次篩選47
• 3.6 第二次篩選后菌落PCR驗證47-48
• 3.7 第二次篩選后菌落Western Blot驗證48-49
• 3.8 M smegmatis mc~2 155 ku-his菌株的Ku-His蛋白的大量純化49
• 3.9 NHEJ修復效率檢測49-51
• 4 討論51-53
• 參考文獻53-58
• 致謝58

【相似文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

1 徐偉文;加蓬Lambarene地區(qū)ICAM-1~(KILIFI)突變株與重癥瘧疾保護的關系[J];國外醫(yī)學.寄生蟲病分冊;2000年06期

2 吳利先;黃文祥;;sprE基因敲除糞腸球菌突變株的構建和功能的初步研究[J];中國人獸共患病學報;2006年09期

3 馬一君;段廣才;張榮光;張衛(wèi)東;范清堂;;幽門螺桿菌中國臨床分離株iceA基因突變株的構建和鑒定[J];世界華人消化雜志;2009年11期

4 張耀超;于丹妮;韓育植;;變異鏈球菌LuxS基因突變株生物被膜結構的電鏡觀察[J];天津醫(yī)科大學學報;2009年04期

5 林維平;劉曉影;武敬亮;高志芹;孫同毅;;大腸桿菌色氨酸操縱子基因突變株的構建與表達[J];中國生物制品學雜志;2010年07期

6 徐君;張園海;申悅平;李晶;;乙型肝炎病毒基本核心啟動子區(qū)A1762T/G1764A雙突變復制質粒的構建[J];江蘇大學學報(醫(yī)學版);2011年03期

7 廖福榮;;假單孢菌突變株產生的7β-(4-羧基丁酰胺基)-頭孢霉烷酸酰化酶的純化與特性[J];國外醫(yī)藥.抗生素分冊;1983年01期

8 熊宗貴;陳桂琴;郭銳;陸泰華;;紅霉素鏈霉菌遺傳控制的研究 一 紅霉素鏈霉菌無活性突變株回復突變株的篩選[J];沈陽藥科大學學報;1984年02期

9 Takashi Kamogashira;廖愛芳;;一種采用環(huán)絲氨酸超敏菌株篩選細胞壁抑制劑的方法[J];國外醫(yī)藥.抗生素分冊;1989年02期

10 張璨;用交互連續(xù)選擇法提高鏈霉菌的抗生素效價[J];國外醫(yī)藥.抗生素分冊;1997年03期

中國重要會議論文全文數據庫 前10條

1 王艷尊;高媛媛;施巧琴;吳松剛;黃建忠;;釀酒酵母YS2-△adh2-△ald6突變株的構建及hxt1基因的過表達[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2009年學術交流會論文摘要匯編[C];2009年

2 田從魁;崔承彬;李長偉;;金灰青霉H4的鏈霉素抗性突變株新產抗腫瘤產物研究[A];中國化學會第八屆天然有機化學學術研討會論文集[C];2010年

3 田從魁;崔承彬;李長偉;;產紫青霉G59的鏈霉素抗性突變株新產抗真菌產物研究[A];中國化學會第八屆天然有機化學學術研討會論文集[C];2010年

4 古力孜拉;史博;熱依汗古麗;吾甫爾·米吉提;;萊茵衣藻(Chlammydomonas reinhardtii)野生型和不同突變株對NaCl抗性檢測分析[A];中國第六屆海峽兩岸菌物學學術研討會論文集[C];2004年

5 王長軍;董瑞萍;潘秀珍;王晶;唐家琪;;突變株的構建及其生物學特性研究[A];第二屆全國人畜共患病學術研討會論文集[C];2008年

6 何秀萍;劉增然;劉春秀;張博潤;;酵母菌細胞自溶突變株的研究[A];首屆中國青年學者微生物遺傳學學術研討會論文摘要集[C];2002年

7 貝為成;何啟蓋;方六榮;金梅林;周銳;陳煥春;;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素apxII基因無藥物抗性標記突變株HBC~-／GFP~+的構建及其生物學特性研究[A];湖北省生物工程學會2004年年會學術報告及論文摘要匯編[C];2004年

8 張輝;肖少波;方六榮;趙騫;薛念波;陳煥春;;偽狂犬病毒UL14基因缺失影響病毒的增殖和細胞間擴散[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2006學術年會論文集（下冊）[C];2006年

9 張金輝;竇穎;佘薇薇;趙耀;劉平;趙曉東;;人類偏肺病毒F蛋白糖基化位點對其體內外復制能力的影響[A];中華醫(yī)學會第十五次全國兒科學術大會論文匯編（上冊）[C];2010年

10 貝為成;何啟蓋;陳煥春;徐曉娟;洪文洲;方六榮;肖少波;宋云峰;;豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌武漢株apxⅡ~-/Amp~r突變株的構建及其安全性和保護性測定[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會成立20周年慶典暨第十次學術研討會論文集（上）[C];2003年

中國重要報紙全文數據庫 前10條

1 知陶;罌粟突變株新發(fā)現：強力鎮(zhèn)痛不成癮[N];醫(yī)藥經濟報;2004年

2 山東 李永強;25cm中星九號專用平板Ku天線檢修一例[N];電子報;2009年

3 江蘇 李育才;頻偏Ku高頻頭起死回生記[N];電子報;2009年

4 黃俊良　張桂新;Ku頻段衛(wèi)星通信系統(tǒng)通過驗收并投入運營[N];中國石化報;2009年

5 河南 張進保;自制C、Ku一體化高頻頭[N];電子報;2009年

6 江蘇 顧孝漁;Ku頭不良引起的一種奇怪故障的修理[N];電子報;2011年

7 江蘇 李育才;簡易實用的Ku鍋體立柱[N];電子報;2008年

8 丹正;功能性大米基爾米實現產業(yè)化生產[N];糧油市場報;2005年

9 岳梅;海正藥業(yè)誘變育種使阿卡波糖產量增加[N];中國醫(yī)藥報;2005年

10 新欣;乙肝表面蛋白有望“預告”肝癌發(fā)生率[N];醫(yī)藥經濟報;2004年

中國博士學位論文全文數據庫 前10條

1 夏靜;豬鏈球菌2型fbps基因突變株的構建及其生物學特性的研究[D];華中農業(yè)大學;2011年

2 楊雪欣;木質纖維的降解及L-乳酸發(fā)酵技術的研究[D];東北林業(yè)大學;2012年

3 郭東春;多殺性巴氏桿菌兔體內差異表達基因及其突變株構建的研究[D];中國農業(yè)科學院;2012年

4 魏巍;苜蓿中華根瘤菌耐鹽分子機制的研究[D];中國農業(yè)大學;2005年

5 李紅權;固氮斯氏假單胞菌四碳二羧酸轉運基因的功能鑒定及表達調控研究[D];中國農業(yè)科學院;2005年

6 向淑利;neuB1基因失活空腸彎曲菌突變株的構建及其臨床意義[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

7 曾愛中;乙肝病毒基因型與應答反應關系及逆轉錄酶和全基因組變異位點分析[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

8 馬一君;幽門螺桿菌iceA基因相關的致病機制[D];鄭州大學;2010年

9 李林;蘇云金芽胞桿菌高頻轉化系統(tǒng)的建立及其性能[D];華中農業(yè)大學;1999年

10 郭巍;山羊痘病毒基因缺失轉移載體及基因缺失突變毒株的構建[D];東北農業(yè)大學;2005年

中國碩士學位論文全文數據庫 前10條

1 王瑩瑩;恥垢分枝桿菌ligD和ku突變株的構建[D];華中農業(yè)大學;2013年

2 程本亮;青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）致病力分化的研究[D];福建農林大學;2010年

3 胡琳琳;胸膜肺炎放線桿菌雙組份調控系統(tǒng)QseB/QseC突變株構建功能研究[D];華中農業(yè)大學;2011年

4 李紅;蘇云金芽胞桿菌YBT1520殺蟲晶體突變株的蛋白質組學分析[D];華中農業(yè)大學;2010年

5 邵慶偉;高產輔酶Q10類球紅細菌突變株的選育[D];福建師范大學;2013年

6 張春;L-蘇氨酸生產菌的選育及其發(fā)酵條件的優(yōu)化[D];吉林農業(yè)大學;2011年

7 寧舒曼;機載天線設計與Ku波段雙工濾波器的機電耦合分析[D];西安電子科技大學;2010年

8 靳軍;Ku波段介質振蕩器的設計[D];電子科技大學;2010年

9 陳葙南;多抗逆性嬰兒雙歧桿菌優(yōu)良菌株的選育及其微膠囊化研究[D];東北林業(yè)大學;2010年

10 克熱木江·阿布都熱合曼;一株產谷胱甘肽啤酒酵母菌株的選育研究[D];蘭州大學;2012年

，

本文編號：538096