本文關鍵詞：HDAC8調控骨髓間充質干細胞成骨分化的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種能夠分化為成骨細胞、成軟骨細胞或成脂細胞的多潛能干細胞。由于易于獲取且免疫反應小等特點，臨床上利用BMSCs進行骨缺損的修復逐漸成為研究者關注的焦點，目前對于BMSCs修復骨缺損能力的研究主要集中于如何提高其成骨分化的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙�；福℉DACs）家族的許多成員在BMSCs成骨分化過程中發(fā)揮重要調控作用，本實驗檢測HDAC8對BMSCs成骨分化能力的影響，并進一步探索HDAC8在BMSCs成骨分化過程中的調控機制，為將來臨床骨缺損再生修復提供實驗依據(jù)。 第一部分：大鼠骨髓間充質干細胞的體外分離培養(yǎng)及生物學特性鑒定 目的：體外提取并培養(yǎng)大鼠BMSCs，對大鼠BMSCs的生物學特性進行鑒定。 方法：利用全骨髓貼壁法體外提取并培養(yǎng)大鼠BMSCs，三天后換液除去造血細胞等未貼壁細胞，待細胞形成單克隆集落并且當各集落相互接觸時進行傳代培養(yǎng)；通過克隆形成率分析、MTT分析、流式細胞周期分析對BMSCs的增殖能力進行鑒定；通過流式細胞儀對BMSCs表面抗原進行檢測；通過礦化誘導、成脂誘導液培養(yǎng)BMSCs并進行油紅O染色、茜素紅鈣結節(jié)染色檢測BMSCs的多向分化能力。 結果：穩(wěn)定培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形，細胞胞體豐滿，胞核較大，呈漩渦分布；體外培養(yǎng)的BMSCs具有較強的自我增殖能力且不易分化；經(jīng)流式表面抗原標記檢測，BMSCs中CD29陽性表達，造血干細胞標記CD34陰性表達；經(jīng)過礦化誘導及成脂誘導后，BMSCs能夠向成骨細胞及脂肪細胞定向分化，具有多向分化潛力。 結論：本實驗通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得BMSCs，體外培養(yǎng)的細胞呈貼壁的紡錘體樣旋渦狀生長，具有自我增殖的能力，表面抗原干細胞標記陽性表達，能夠在誘導下多向分化，具有干細胞特性，為后續(xù)實驗奠定了基礎。 第二部分：HDAC8對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響 目的：檢測大鼠BMSCs成骨分化過程中HDAC8的表達規(guī)律，研究HDAC8在BMSCs成骨分化過程中所發(fā)揮的作用。 方法：1、Western blot及免疫熒光細胞化學檢測BMSCs成骨分化過程中HDAC8的表達規(guī)律；構建HDAC8過表達慢病毒載體并轉染大鼠BMSCs，實時定量PCR及Western blot檢測轉染效率；MTT檢測轉染后BMSCs的增殖情況；堿性磷酸酶活性測定、茜素紅鈣結節(jié)染色、Western blot及實時定量PCR檢測礦化誘導7天后BMSCs成骨能力的變化。2、加入1mM VPA后，，Western blot檢測BMSCs中HDAC8的表達，MTT檢測BMSCs的增殖情況，茜素紅礦化結節(jié)染色、Westernblot及實時定量PCR檢測BMSCs成骨能力的變化；HDAC8-siRNA化學干擾試劑轉染BMSCs，Western blot及實時定量PCR檢測轉染效率及礦化誘導7天后BMSCs成骨能力的變化；轉染HDAC8過表達慢病毒載體的BMSCs中加入1mM VPA，實時定量PCR及Western blot檢測礦化誘導7天后過表達HDAC8的BMSCs成骨能力的變化。 結果：1、BMSCs成骨分化過程中HDAC8表達呈遞減趨勢；HDAC8過表達慢病毒載體轉染BMSCs后倒置熒光顯微鏡觀察轉染效率，大部分BMSCs表達綠色熒光，HDAC8蛋白水平及mRNA水平明顯上調，轉染后BMSCs的增殖能力未見明顯改變；礦化誘導7天后轉染HDAC8過表達慢病毒載體的BMSCs成骨相關基因表達下降且礦化結節(jié)形成能力下降。2、加入1mM VPA后，BMSCs的HDAC8在24小時內(nèi)表達逐漸下降，且BMSCs的增殖能力有所下降，礦化誘導7天后BMSCs的成骨相關基因表達增強且礦化結節(jié)形成能力增強；轉染HDAC8-siRNA化學干擾試劑后BMSCs的HDAC8表達明顯降低，礦化誘導7天后其成骨能力有所增強；轉染HDAC8過表達慢病毒載體的BMSCs中加入1mM VPA后經(jīng)礦化誘導，成骨相關基因的表達均有增強。 結論：HDAC8對大鼠BMSCs成骨分化具有抑制作用。 第三部分：HDAC8在大鼠BMSCs成骨分化過程中的調控機制 目的：檢測大鼠BMSCs成骨分化過程中組蛋白H3K9乙�；降淖兓�(guī)律，研究組蛋白H3K9、HDAC8與RUNX2的相互作用，進一步探索HDAC8在大鼠BMSCs成骨分化過程中的調控機制。 方法：Western blot及免疫熒光細胞化學檢測BMSCs成骨分化過程中組蛋白H3K9乙�；降淖兓�(guī)律；Western blot檢測過表達HDAC8的BMSCs及抑制或干擾HDAC8的BMSCs中組蛋白H3K9的乙酰化水平；ChIP檢測礦化誘導前后RUNX2啟動子區(qū)組蛋白H3K9的乙�；阶兓�；co-IP檢測礦化誘導前后HDAC8與RUNX2的相互作用。 結果：BMSCs成骨分化過程中組蛋白H3K9的乙�；街饾u增強；HDAC8過表達的BMSCs中組蛋白H3K9的乙�；较陆�，而HDAC8受到抑制或者干擾的BMSCs中組蛋白H3K9的乙酰化水平有所提高；ChIP結果顯示礦化誘導后RUNX2啟動子區(qū)組蛋白H3K9乙�；捷^誘導前高，co-IP結果顯示HDAC8與RUNX2在此次免疫共沉淀中均有表達，并且在礦化誘導后RUNX2結合的HDAC8蛋白水平較誘導前有所下降。 結論：HDAC8一方面通過直接與成骨關鍵調控因子RUNX2結合，抑制BMSCs的成骨分化；另一方面通過調節(jié)組蛋白H3K9乙�；介g接調控RUNX2的轉錄從而抑制BMSCs成骨分化。
【關鍵詞】：組蛋白去乙酰化酶8 runt-相關轉錄因子2 骨髓間充質干細胞 成骨分化 組蛋白H3K9乙�；�
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 第一部分 大鼠骨髓間充質干細胞體外分離培養(yǎng)和生物學特性鑒定18-32
• 材料和方法18-23
• 結果23-29
• 討論29-31
• 小結31-32
• 第二部分 HDAC8 對大鼠骨髓間充質干細胞成骨分化的影響32-64
• 第一節(jié) HDAC8 過表達載體的構建及其對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響32-54
• 材料和方法32-46
• 結果46-54
• 第二節(jié) HDAC8 抑制對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響54-61
• 材料和方法54-55
• 結果55-61
• 討論61-63
• 小結63-64
• 第三部分 HDAC8 在大鼠 BMSCs 成骨分化過程中的調控機制64-77
• 材料和方法64-70
• 結果70-74
• 討論74-76
• 小結76-77
• 全文總結77-79
• 參考文獻79-84
• 綜述84-98
• 參考文獻92-98
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況98-99
• 致謝99

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 夏靖;馮冰虹;;組蛋白去乙�；�(HDACs)的研究進展[J];廣東藥學院學報;2010年05期

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  本文關鍵詞：HDAC8調控骨髓間充質干細胞成骨分化的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：473107