本文關(guān)鍵詞：cAMP受體蛋白調(diào)控肺炎克雷伯菌kfuABC操縱子的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae,KP）屬于革蘭氏陰性腸桿菌。近年來成為僅次于大腸桿菌的條件致病菌，主要引起社區(qū)獲得性和醫(yī)院內(nèi)感染，常見的疾病有肝膿腫、肺炎、眼內(nèi)炎和腦膜炎等。KP的毒力因子主要包括莢膜多糖，脂多糖，鐵攝取因子和Ⅰ型菌毛等。鐵元素（Fe）是KP生長繁殖所必需的微量元素，鐵在KP體內(nèi)大多以螯合形式存在，KP必須有自己的鐵攝取系統(tǒng)來滿足菌體生長對(duì)鐵的需要。kfuABC系統(tǒng)是KP多個(gè)鐵攝取系統(tǒng)的其中之一，參與菌體對(duì)鐵的攝取，是KP重要毒力基因。cAMP受體蛋白(cAMP receptorprotein，CRP)是病原菌的重要全局調(diào)控子，參與調(diào)節(jié)菌株的眾多分解代謝基因和毒力基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。然而在KP中，CRP調(diào)控kfuABC基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究還處于開始階段。 研究目的深入研究cAMP受體蛋白對(duì)肺炎克雷伯菌kfuABC操縱子的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，為控制肺炎克雷伯菌菌株的毒力奠定基礎(chǔ)。 研究方法首先，通過測(cè)定生長曲線觀察CRP對(duì)菌體生長的影響，利用超粘性實(shí)驗(yàn)證實(shí)CRP對(duì)毒力表型的影響。設(shè)計(jì)相關(guān)跨基因引物，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR鑒定kfuABC操縱子的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)。提取肺炎克雷伯菌野生株NTUH-K2044(wild type，WT)的總RNA,采用引物延伸實(shí)驗(yàn)研究kfuA的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增kfuA的啟動(dòng)子區(qū)序列，擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收，酶切連接入pHRP309質(zhì)粒無啟動(dòng)子區(qū)β-半乳糖苷酶基因的上游，獲得重組質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)入WT和肺炎克雷伯菌株crp基因突變株（△crp）中,通過測(cè)定WT和△crp的β-半乳糖苷酶活性來判定CRP調(diào)控子對(duì)kfuA的調(diào)控關(guān)系；分別提取WT和△crp的總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過比較kfuA在WT和△crp中的表達(dá)量來進(jìn)一步驗(yàn)證CRP調(diào)控子對(duì)kfuABC的調(diào)控關(guān)系。PCR擴(kuò)增kfuABC啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列，表達(dá)純化出有活性的His-CRP蛋白，通過凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CRP對(duì)kfuA啟動(dòng)子區(qū)是否有直接的結(jié)合，最后采用DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)確定具體的結(jié)合位點(diǎn)。 研究結(jié)果生長曲線結(jié)果表明肺炎克雷伯菌crp基因敲除后，其生長速度明顯慢于野生株和回補(bǔ)株；超黏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示△crp的超黏性小于WT。肺炎克雷伯菌kfuA、kfuB和kfuC位于一個(gè)操縱子kfuABC上，引物延伸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)kfuABC上只有一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，其轉(zhuǎn)錄受到CRP調(diào)控子的抑制。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn)表明CRP能直接結(jié)合到kfuABC啟動(dòng)子區(qū)的-204到-171之間的堿基序列上（轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為+1）。 研究結(jié)論crp基因的敲除使得肺炎克雷伯菌的生長速度減慢，KP超黏性的形成能力降低，菌株的毒力減弱。CRP調(diào)控子能直接結(jié)合到kfuA的啟動(dòng)子區(qū)，抑制kfuA基因的轉(zhuǎn)錄。本研究首次闡釋了肺炎克雷伯菌CRP對(duì)kfuABC的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步解析肺炎克雷伯菌毒力因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：肺炎克雷伯菌 CRP 調(diào)控 kfuABC操縱子
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R378.996
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-6
• 中文摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 前言11-14
• 1 材料14-21
• 2 方法21-39
• 3 結(jié)果39-47
• 4 討論47-50
• 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 文獻(xiàn)綜述56-66
• 參考文獻(xiàn)60-66
• 致謝66-67
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄67-68

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 楊琳;高鶴;張義全;劉霞;譚亞芳;郭兆彪;黃新祥;楊瑞馥;周冬生;;鼠疫菌、副溶血性弧菌及肺炎克雷伯菌CRP蛋白的表達(dá)及其DNA結(jié)合活性分析[J];中國媒介生物學(xué)及控制雜志;2011年03期

  本文關(guān)鍵詞：cAMP受體蛋白調(diào)控肺炎克雷伯菌kfuABC操縱子的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：424689