發(fā)布時(shí)間：2022-07-12 17:26

　　人FL（flt3 ligand）是近年發(fā)現(xiàn)的重要造血細(xì)胞因子，其功能類似于hSCF，主要作用于早期原始的干／祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化，與其它細(xì)胞因子聯(lián)合應(yīng)用，可產(chǎn)生明顯的協(xié)同作用。與hSCF不同的是，hFL對(duì)肥大細(xì)胞沒有作用，沒有種屬特異性，并且可顯著刺激樹突狀細(xì)胞（DC）和自然殺傷細(xì)胞（NK）的增殖。這些功能使FL在造血系統(tǒng)原發(fā)性或繼發(fā)性損傷疾病的治療、造血干細(xì)胞移植，特別是在腫瘤免疫基因治療和免疫疫苗制備等方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。DCs細(xì)胞作為功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞（APC），在免疫應(yīng)答反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，能誘導(dǎo)非特異性先天免疫反應(yīng)和特異性獲得免疫反應(yīng)。利用FL擴(kuò)增DCs的抗腫瘤免疫治療效果，在動(dòng)物模型中已得到驗(yàn)證。本研究利用hFL能顯著刺激體內(nèi)DCs增殖的生物學(xué)特性，用基因工程方法表達(dá)重組hFL，對(duì)小鼠種植瘤進(jìn)行抑瘤效果試驗(yàn)，為進(jìn)一步研究hFL在腫瘤免疫治療中的有效作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本論文主要包括兩部分內(nèi)容： 一、應(yīng)用酵母表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)分泌性人FL（hFL）的K84E／Q122R突變體。hFL第84位和122位氨基酸的密碼子分別改造為E和R的密碼子，并在N端采用甲醇酵母... 

【文章頁(yè)數(shù)】：131 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
圖表目錄
中文摘要
Abstract
英文略語(yǔ)表
前言
第一部分 人FL在甲醇酵母中表達(dá)、純化、體外活性測(cè)定及小鼠抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
    1 實(shí)驗(yàn)材料
        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
        1.2 菌株
        1.3 質(zhì)粒
        1.4 工具酶
        1.5 主要化學(xué)試劑
        1.6 細(xì)胞培養(yǎng)試劑和消耗材料
        1.7 其它材料
        1.8 主要儀器及設(shè)備
        1.9 培養(yǎng)基的配制
        1.10 主要溶液配方
        1.11 引物
    2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
        2.2 重組蛋白在Pichia pastoris中的表達(dá)及純化
        2.3 重組蛋白理化性質(zhì)測(cè)定
        2.4 重組蛋白體外活性測(cè)定
        2.5 鼠皮下移植EL4淋巴瘤模型的治療實(shí)驗(yàn)
    3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.1 人FL基因的獲得
        3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-hFL的構(gòu)建
        3.3 重組蛋白在Pichia pastoris中的表達(dá)及純化
        3.4 hFL理化性質(zhì)測(cè)定
        3.5 hFL體外活性測(cè)定
        3.6 重組蛋白體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)
    4 討論
        4.1 甲醇酵母高表達(dá)轉(zhuǎn)化子的篩選方法
        4.2 hFL表達(dá)條件優(yōu)選
        4.3 hFL的糖基化
        4.4 hFL活性檢測(cè)
第二部分 腺病毒介導(dǎo)人FL和人GM-CSF聯(lián)合基因治療惡性腫瘤
    5 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1 細(xì)胞系
        5.2 菌株
        5.3 質(zhì)粒
        5.4 其它材料
        5.5 引物
    6 實(shí)驗(yàn)方法
        6.1 重組腺病毒pAd-hFL-hGM-CSF和pAd-GFP的構(gòu)建
        6.2 體內(nèi)外表達(dá)量測(cè)定
        6.3 體外活性測(cè)定
        6.4 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因擴(kuò)增脾臟樹突狀細(xì)胞
        6.5 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因治療惡性腫瘤
    7 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        7.1 高滴度重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF和Ad-GFP的制備
        7.2 體內(nèi)外表達(dá)量測(cè)定
        7.3 體外活性測(cè)定
        7.4 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因擴(kuò)增脾臟樹突狀細(xì)胞
        7.5 重組腺病毒Ad-hFL-hGM-CSF聯(lián)合基因治療惡性腫瘤
        7.6 腫瘤組織病理切片
    8 討論
        8.1 穿梭質(zhì)粒的改造與構(gòu)建
        8.2 細(xì)菌內(nèi)同源重組
        8.3 重組腺病毒的包裝
        8.4 重組腺病毒表達(dá)hFL和hGM-CSF及體內(nèi)外活性實(shí)驗(yàn)
小結(jié)
論文參考文獻(xiàn)
綜述一：FL在骨髓的造血和免疫功能調(diào)控中的作用
綜述二：靶向腺病毒載體
綜述三：造血干細(xì)胞基因治療研究進(jìn)展
綜述四：真核DNA復(fù)制機(jī)制的研究進(jìn)展
博士期間發(fā)表論文、綜述及專利情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]瘤內(nèi)注射攜帶Flt3配體的重組腺病毒治療小鼠肝癌[J]. 楊慶,楊廣順,衛(wèi)立辛,楊寧,賈鳳歧,吳孟超.  中華實(shí)驗(yàn)外科雜志. 2002(04)
[2]腺病毒介導(dǎo)的小鼠Flt3配體抗肝癌基因治療的研究[J]. 楊慶,楊廣順,衛(wèi)立辛,賈鳳岐,吳孟超,郭亞軍.  中華醫(yī)學(xué)雜志. 2002(11)
[3]人FL在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化和生物學(xué)活性測(cè)定[J]. 張友鴻,周希亞,陳松森,婁可佳,劉深基,楊克恭,何維.  基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 2002(02)
[4]人FL基因高效真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 王冠軍,馬俐君,李梁,裴雪濤.  中國(guó)免疫學(xué)雜志. 2001(06)
[5]人白細(xì)胞介素-17基因的克隆、表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的分離純化[J]. 王建勛,陳松森,狄旭,宋衛(wèi)華.  中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào). 1999(03)
[6]腺病毒載體效能改進(jìn)[J]. 徐敏毅.  中國(guó)腫瘤生物治療雜志. 1999(01)
[7]人干細(xì)胞因子cDNA克隆及其在大腸桿菌中的高效表達(dá)[J]. 陳衛(wèi)東,狄旭,李江,宋飛,陳松森,梁植權(quán).  中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào). 1997(01)
[8]人胎肝FLT3配基膜外區(qū)基因的克隆及其在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)[J]. 周生,毛寧,劉元林,杜德林,唐佩弦,潘凌亞.  實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志. 1996(03)



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