發(fā)布時間：2020-12-19 02:04

　　天然免疫是機體抵抗病原微生物入侵的一道有力屏障。功能正常的天然免疫能使機體長期維持在比較健康的狀態(tài),而功能失調(diào)的天然免疫,則容易導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。免疫調(diào)節(jié)對維持正常的天然免疫功能至關(guān)重要。近年來,關(guān)于天然免疫的調(diào)節(jié)一直都是研究人員感興趣的研究領(lǐng)域。TLRs是天然免疫細胞上表達的一類主要的模式識別受體,對TLRs信號通路的深入研究將有助于我們對天然免疫調(diào)節(jié)的全面認識。本課題主要是在巨噬細胞中探討RasGRP3和Ca2+對TLRs觸發(fā)的免疫應(yīng)答強度的調(diào)節(jié)。第一部分RasGRP3負調(diào)巨噬細胞中TLRs觸發(fā)的IL-6的產(chǎn)生及其分子機制研究天然免疫在宿主抗感染免疫過程中發(fā)揮著不可替代的作用。當(dāng)有病原微生物入侵機體時,天然免疫細胞會第一時間檢測到病原微生物入侵并啟動抗感染免疫應(yīng)答。在我們的日常生活中,病原微生物無處不在,我們的皮膚、粘膜等組織時刻都會和病原微生物發(fā)生接觸,然而在我們體內(nèi),天然免疫細胞并不會每時每刻都對它們所監(jiān)測到的病原微生物啟動抗感染免疫應(yīng)答。在長期進化過程中,天然免疫細胞形成了一套非常完善的啟動免疫應(yīng)答的準入標準：當(dāng)監(jiān)測到的病原微生物信號非常微弱時,天然免疫細胞不會產(chǎn)生應(yīng)答；只... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：122 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

4模式圖顯示SOS和RasGRP根據(jù)刺激物濃度介導(dǎo)細胞應(yīng)答的強度Figure1.3.4ModeofSOSandRasGRPmediatedstrengthofcellresponseaccording

用較低濃度的LPS、Poly (I:C)或CpG ODN刺激巨唾細胞時，其他細胞因子也均有一定程度的增加，如TOF-ct、IL-ip和iNOS等（如圖1.3.5a-c),只是3 DCtrl siRNA b DCtrl siRNA C DCtrl siRNA■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRP3 siRNA ■ RasGRPS siRNA9" 200 iTNFa *** ^ 2001/1-1/3 互 150 飛iNOSh I . |i5。l ni M II 100 門■門■ I 100 I I 1 鬥| iI 50 [l|n| I I 5ol |n|n| I 叫門Ifll nsI LIfll I I oLI^JniMed LPS (l;C) CpG Med LPS (l:C)CpG Med LPS(l;C)CpG圖1.3.5在巨嗟細胞中敲低RasGRP3的表達促進TNF-ot以及iNOS的產(chǎn)生Figure 1.3.5 Knockdown of RasGRP3 promotes TNFa, IL-ip and iNOSexpression in macrophages. Peritoneal macrophages were transiently transfected withcontrol (Ctrl) or RasGRPS-specific siRNAs for 48h. Cells were treated with 1 ng/mlLPS, 2.5 [xg/ml Poly (I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h. Then mRNA levels of TNFa(a), IL-ip (b) and iNOS (c) were determined by Q-PCR. Data are representative ofthree technical repeats with mean士s.d. ns, not significant; *, P < 0.05; **，P < 0.01;***，尸 <0.001 (ANOVA).RasGRP3對這些細胞因子的影響沒有RasGRP3對IL-6的影響那么顯著。從而表明在較低濃度的刺激物作用下，RasGRP3主要能抑制巨嗟細胞中IL-6的產(chǎn)生。由于我們平時在實驗過程中所使用的刺激物的濃度(如100 ng/ml LPS)遠高于正常生理條件下機體細胞所能接觸到的病原微生物的濃度

Poly (I:C)或CpG ODN作用下，過表達RasGRP3分子能顯著抑制巨嗟細胞系RAW264.7細胞系中IL-6的表達(如圖1.3.7b，c)。進一步表明RasGRP3確實能在低濃度刺激物作用下負調(diào)TLRs觸發(fā)的IL-6的產(chǎn)生。3 b DMock C OMock■ RasGRPS _RasGRP3(5r\i *?*■* *** *** AC\C\^ *** *** ***w I' I f 1 { I jii I 1J 1*1 n2 < .n f 300ct 2 40 Eo ^ 1 廣] a 200 [-]o TO ^ 一tr g> 20 ^！B: Flag I i 門 -^00 Bp' ‘ Med LPS (l:C)CpG Med LPS (l:C)CpG圖1.3.7在巨唾細胞中過表達RasGRP3能抑制IL-6的產(chǎn)生Figure 1.3.7 RasGRPS inhibits IL-6 production in macrophages, (a-c) RAW264.7cells stably transfected with Flag-tagged RasGRP3 were examined for RasGRPSexpression by Western blot (a)，or treated with or without 1 ng/ml LPS, 2,5 jxg/ml Poly(I:C) or 6 |ig/ml CpG ODN for 6h (b，c). Then IL-6 mRNA levels and the IL-6 proteinswere examined by Q-PCR (b) and ELISA (c) respectively. Data in (b，c) arerepresentative of three technical repeats with mean士s.d. ns, ***，P < 0.001 (ANOVA).3.4 RasGRP3分子的活化依賴于PKC對RasGRP3第155位蘇氨酸的碟酸化以往的研究表明在B細胞中，BCR/Ras信號通路的活化依賴于PKC對RasGRP3第155位蘇氨酸的礎(chǔ)酸化[37，38]。所以我們就想看看在巨唾細胞中


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