乙型肝炎是一種由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染引起的嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，目前全球范圍內(nèi)大約有超過3.5億人受到HBV危害。大約有15～40％的HBV感染者最終會發(fā)展為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝硬化和肝衰竭。我國是乙型肝炎主要的流行區(qū)，現(xiàn)患慢性乙型肝炎的病人已突破1000萬。迄今為止，慢性乙型肝炎的治療仍無良策，因此，研制新型HBV疫苗和尋求有效的治療乙型肝炎的手段迫在眉睫。2型重組腺相關(guān)病毒(adeno-associated vires type 2，rAAV-2)作為一種大有希望的基因轉(zhuǎn)移載體，因能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)多種組織和細胞而引起了人們的高度重視。為此，本研究以研制新型HBV疫苗為目的，構(gòu)建了表達HBV外膜主蛋白、大蛋白基因的rAAV-2，初步研究了其免疫原性，并探討了表達HBV抗原基因的rAAV-2用于以樹突狀細胞(dendritic cell，DC)為基礎(chǔ)的慢性乙型肝炎免疫治療的可行性。 采用PCR法從PTHBV—1質(zhì)粒中擴增HBV(ayw亞型)外膜主蛋白(HBsAg)、大蛋白(LHBsAg)基因；將PCR擴增產(chǎn)物插入rAAV-2表達質(zhì)粒pSNAV中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSNAV-HBsAg和pSNAV-LHBsAg；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BHK—21細胞中，G418篩選得到轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒并能表達目的基因細胞系BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg；用具有rAAV包裝功能的重組單純皰疹病毒(HSV1-rc/ΔUL2)感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg，純化后得到rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg；用高效液相色譜儀(HPLC)檢測和SDS—聚丙稀酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測了rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-LHBsAg的純度；以點雜交方法檢測重組病毒的物理滴度；ELISA檢測混合細胞系 博士論文:，、HB、，卜膜主蛋。、、蛋。、重組腺，關(guān)病毒的構(gòu)減巍免。性研究 BHK一HBsAg和BHK~LHBsAg中表面抗原(HBsAg)的表達，rAA認HBsAg和 rA戌認LHBsAg在BHK一21細胞和293細胞中的表達。結(jié)果表明，H衛(wèi)LC分析顯 示主峰為總面積大于99%;SDS一PAGE電泳結(jié)果顯示3條特征性條帶，其間的 雜蛋白量非常少;點雜交檢測rA戌瞬2一HBsAg和rAA認2.LHBsAg的物理滴度分 別為sxlo，‘和ZxlolZ virusp耐cles/nil(vp翔吐);混合細胞株BHK一HBsAg中 HBsAg的表達量為28.6士6.7ng乃x ro6eells，BHK~LHBsAg中HBsAg的表達量 為15.4士5.5 ng zsxl06eeus;rA戌認2~HBs^g和rAAv-2~LHBsAg感染BHK一21 細胞和293細胞后均能檢測到HBsAg的表達，表達量隨感染復(fù)數(shù)(伽ltiplicityof infection，MOI)的增加而升高。提示我們已經(jīng)獲得了高滴度、高純度、在體外能 有效地感染培養(yǎng)細胞的rAAV-2一HBsAg和rAAv-2.LHBSAg，為下一步工作奠定 了基礎(chǔ)。 本文首次報道了rA戌認2載體介導(dǎo)HBV抗原基因用于HBV疫苗的研究。通 過肌肉注射、尾靜脈注射、腹腔注射和胃飼給藥途徑，我們觀察了rA入v-2~HBsAg 和rAA認2.LHBsAg在小鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HBv抗原特異性的體 液和細胞免疫反應(yīng)的能力。結(jié)果顯示，rAAv-2~HBsAg和rAAv-2.LHBsAg通過 肌肉注射、尾靜脈注射、腹腔注射和胃飼途徑進入小鼠體內(nèi)后能有效表達HBsAg， 同一給藥途徑，rA戌瞬2.HBsAg和rA入叭2~LHBsAg在小鼠體內(nèi)HBsAg的表達水 平無明顯差異(p0 .05);同一重組病毒(rA戌認2一HBsAg或rAAV一2一LHBsAg) 不同給藥途徑之間HBsAg的表達水平亦無明顯差異(p0 .05)。重組病毒通過不 同途徑在小鼠體內(nèi)表達的同時，可在較長時間(80天)誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生HBV抗原 特異性的體液和細胞免疫反應(yīng):不同給藥途徑之間的免疫效果比較發(fā)現(xiàn)，肌肉注 射、尾靜脈注射、腹腔注射和胃飼都能誘發(fā)機體產(chǎn)生HBV保護性抗體和激發(fā)CTL 產(chǎn)生，但以尾靜脈注射效果最好，腹腔注射、肌肉注射和胃飼三者之間差別不大 (p0 .05);在各種給藥途徑中，免疫反應(yīng)能否出現(xiàn)、以及免疫反應(yīng)的強度與劑 量(給予的重組病毒顆粒數(shù))有關(guān)。結(jié)果提示，基于rAAV載體的HBV疫苗， 對于防止HBV感染，尤其是作為慢性乙型肝炎的治療性疫苗和應(yīng)用于對現(xiàn)有 HBV疫苗無反應(yīng)的患者無疑具有潛在的應(yīng)用價值，值得做進一步的系統(tǒng)研究。 近年來，以DC為基礎(chǔ)的免疫治療已成為抗腫瘤和抗感染等研究的熱點，本 文也探討了表達HBV抗原基因的rAA認2載體用于DC為基礎(chǔ)的慢性乙型肝炎免 疫治療的可行性。首先，我們用表達報告基因一綠色熒光蛋白(GFP)基因和熒 光素酶(luciferase，Luc)的rA月認2(分別簡稱為rAA認GFP和rAAV-Luc)感染 了人外周血單核細胞來源DC以觀測感染效能，在激光共聚焦顯微鏡觀察了F仃C 博士論文:表達HBV外膜主蛋白、大蛋白的重組腺相關(guān)病毒的構(gòu)建及其免疫原性研究 (fluorescein 150而Ocyanate，F(xiàn)ITC，異硫氰酸熒光素)標記的rAA認2進入Dc的 動態(tài)過程;結(jié)果顯示，激光共聚焦顯微鏡下觀察到了rAAV-2能進入DC;只有 當Mol(multiplicity of infeetion，感染復(fù)數(shù))大于1 X losvp/c ell時，乙AAV-2一lue 和rA戌認2一GFP才能有效感染DC，需較高的MOI值的重組病毒才能有效感染 Dc，報告基因的表達水平在MOI值為1 X 105一5 x 106vPlcell之間呈劑量依賴趨 勢，此后再提高MOI值并不能明顯提高表達水平，感染后的DC表達水平不高。 表明rAA認2可以有效感染DC，但轉(zhuǎn)導(dǎo)效率?
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

如7.6ngpSNAV的拷貝數(shù)=7.6x10一gx6.oZ=10X10812.4.7.3結(jié)果判定比較樣品與標準質(zhì)粒的雜交信號強度，滴度(vp/nil)=對應(yīng)的拷貝數(shù)X2X100O13.rA月叭2-HBsAg和rAAV‘2·LHBsAg體外感將96孔板中60一70%滿的細胞(約2一3x或DMEM)洗二次，以Mol為1x104、5x1xlo7virusp洲eleszeell(vp/cell)的rAAv-2一皿BHK一21細胞和293細胞，吸附lh后，加入含感染后第3天用ELISA試劑盒檢測上清和細胞書進行操作)中HBsAg的含量。二結(jié)果(一)PCR擴增HBV主蛋白和大蛋白基因LanelLaneZLan侖3

大蛋白基因(L)，擴增區(qū)域為bp2827一865，兩端分別含KPnl和Bgln酶切位點，擴增后的片段全長為1235bp。在瓊脂糖凝膠上可見大小分別約為700bp和12O0bp兩條DNA擴增帶(圖1一2)。測序結(jié)果表明，S片段和L片段與皿v(ayw亞型)相應(yīng)位置的核昔酸序列完全一致。(二)pMD18一T-s和pMD18一T-L酶切鑒定結(jié)果l朋elLaneZLane3圖1一3.pMD18一T-s和pMD18一T-L酶切分析Figl一3.MapofPMD18一T-SandPMD18一T-Ldigestedwithendonueleases.Lanel:PMD18一T-LdigestedwithKPn1andBgl11:LaneZ:DNAmarker口L2000);Lane3:PMD18一T-SdigestedwithEeoR1andBgl11.PCR擴增產(chǎn)物連接于pMD18一T后，轉(zhuǎn)化DHS。，提取質(zhì)粒，分別用EcoRI和Bglll、KPnl和Bglll酶切鑒定，可得到大小相符的兩條DNA條帶(結(jié)果見圖1一3)。純化回收后得到S片段和L片段。(三)重組質(zhì)粒pSNAV.2.HBsAg和pSNAV‘2一LHBsAg的構(gòu)建為建立攜帶外源基因的rAA協(xié)2載體細胞株，中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所基因工程國家重點實驗室構(gòu)建了攜帶新霉素抗性基因、適合多種外源基因插入的通用型rAA認2載體質(zhì)粒psNAV-2(41)。PSNAv-2含有AAv‘2兩端的仃R，中間依次為CMV立早增強子和啟動子、多克隆位點和polyA信號，其中供外源基因插入的多克隆位點為EcoRI、sal、KPnl和Bglll等

KPnl和Bglll雙酶切pMD18一T-L得到的L片段連接。轉(zhuǎn)化DH5a，挑取其中各6個單菌落提取質(zhì)粒，酶切鑒定結(jié)果表明分別得到5個和6個連接正確的重組子，分別命名為PSNA認2-HBsAg和pSNAv-2-LHBsAg(圖1一4為正確的重組子酶切圖)。目的基因的正向插入應(yīng)分別能切下約700bp和1.2kb片段。Lan叭L。打。ZL助。3圖1一4.PsNAV‘2一IIBsAg和PSNAv‘2~LHBsAg酶切鑒定圖.Figl一4·IdentificationmaPofpSNAV-2一HBsAgandpSNAV-2一LHBsAgdigested.withendonucleases.Lanel:PSNAV‘2一HBsAgdigestedwithEcoR1andBgl11:LaneZ:PSNAV-2一LHBsAgdigestedwithKPn1andBgl11;Lane3:DNAmarker(DL150OO).(四)混合細胞株BHK.HBsAg和BHK·LHBsAg上清中HBsAg的檢測結(jié)果將pSANV-HBsAg和pSNAV‘2一LHBsAg分別轉(zhuǎn)染的BHK一21細胞在含G418的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)九天，對照組細胞(未轉(zhuǎn)染的BHK一21細胞)全部死亡，轉(zhuǎn)染的細胞約死亡30%。各取擴大培養(yǎng)細胞一小方，用PBS洗三遍，反復(fù)凍融三次，上清用ELISA試劑盒檢測HBsAg的表達，混合細胞株BHK一HBsAg表達量為25.6士6.7ng25xlo6eells，BHK一研BsAg中皿sAg的表達量為15.4士5.5ng/5x106eeUS。證明S基因和L基因能在混合細胞系中表達。(五)rA戌叭2-HBsAg和rAAV‘2·LHBsAg純度檢測結(jié)果分別以0.1的Mol的輔助病毒感染BHK-HBsAg和BHK-LHBsAg
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2888211