成骨蛋白-1(Osteogenic Protein-1，OP-1)又稱骨形成蛋白-7(Bone Morphogenetic Protein，BMP-7)。最早由Ozkaynak發(fā)現(xiàn)，并于1990年將其基因克隆成功。隨后對(duì)它的蛋白組成、生物學(xué)作用等有了深入的認(rèn)識(shí)。OP-1屬TGF-β超家族，與TGF-β家族成員有很高的同源性。人的OP-1基因位于第20號(hào)染色體上，其全長(zhǎng)cDNA 1878bp，開(kāi)放讀框1296bp，編碼431個(gè)氨基酸，由N端的信號(hào)肽、中間的前肽和C端的成熟肽構(gòu)成。成熟而具有活性的OP-1，以二聚體糖蛋白形式存在。OP-1除具有BMP家族成員所特有的骨誘導(dǎo)功能外，還與牙齒發(fā)育，牙體、牙周組織的修復(fù)和礦化，造血系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)等許多重要的生理功能有關(guān)。然而，由于天然來(lái)源的OP-1數(shù)量有限，對(duì)其功能研究及應(yīng)用都受到了極大的限制，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，使大規(guī)模生產(chǎn)具有活性的OP-1重組蛋白質(zhì)成為可能。 為了拓寬OP-1的研究與應(yīng)用，通過(guò)基因工程技術(shù)，獲得具有生物學(xué)活性的OP-1蛋白質(zhì)，探討其在牙齒發(fā)育、礦化中的作用機(jī)制，以及作為一種新的牙髓、牙周病治療材料用于臨床，促進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)的形成和牙周組織再生等。本課題主要進(jìn)行了以下幾方面的研究： 一．OP-1成熟肽基因的克隆及多克隆抗體制備 本實(shí)驗(yàn)首先利用RT-PCR技術(shù)，從培養(yǎng)的人牙乳頭細(xì)胞中，克隆出人OP-1成熟肽段基因，并在pEH4原核表達(dá)載體中獲得高表達(dá)，表達(dá)量占菌體總蛋白的33％左右。將表達(dá)蛋白初步純化，免疫新西蘭大白兔，獲得了兔抗人OP-1多克隆抗血清，效價(jià)為1∶100000，為真核系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物的免疫學(xué)檢測(cè)及其OP-1的表達(dá)和功能研究創(chuàng)造了條件。 二．OP-1全長(zhǎng)基因克隆及CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在OP-1原核表達(dá)并制備多克隆抗血清的基礎(chǔ)上，進(jìn)行OP-1真核系統(tǒng)表達(dá)研究。通過(guò)獲得的人牙乳頭細(xì)胞總RNA，首次采用擴(kuò)增高GC含量基因的PCR試劑盒，得到hOP-1約1300bp的全長(zhǎng)段基因。序列測(cè)定正確后，插入pCI高效真核表達(dá)載體，并利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2000
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)的菌落，按質(zhì)粒提取EeoRI和Sall進(jìn)行雙酶切，即在10林l酶(0.5協(xié)g一1.0件g)，相應(yīng)的loxbueffrl協(xié)l，加重制性內(nèi)切酶各0.5川，37”C溫育lh，進(jìn)行瓊脂同時(shí)將所提質(zhì)粒按1:100稀釋后做為PC原PCR條件，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠2.8核昔酸序列分析將酶切和PCR擴(kuò)增鑒定的陽(yáng)性克隆提取質(zhì)3.結(jié)果3.1總RNA提取將所提取的人牙乳頭細(xì)胞總RNA進(jìn)行瓊8sl和5s三條帶，分光光度計(jì)測(cè)定A26了A280=.0所獲得的總RNA無(wú)明顯的降解并且有較高的196林留ml。(圖l)

PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒的酶切Lane1PCRMarkerLaneZ重組質(zhì)粒酶切鑒定Lane3PCRrfagment組質(zhì)粒進(jìn)行核昔酸序列測(cè)定，一致(圖4)。1)，具有很強(qiáng)的骨誘導(dǎo)作用，能進(jìn)修復(fù)性牙本質(zhì)，牙骨質(zhì)的形、骨骼及胎盤(pán)等組織[’]，對(duì)胚胎觀的臨床應(yīng)用前景[5]。已有文一1的表達(dá)，但有關(guān)在人牙胚發(fā)育

6hOP一1P/EH4表達(dá)載體的酶Lanel重組質(zhì)粒酶切鑒定LnaeZ重組質(zhì)粒L即e3DNAM肚ker大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)重組陽(yáng)性克隆，通過(guò)溫度誘導(dǎo)目陽(yáng)性克隆，經(jīng)溫度誘導(dǎo)后，SDS一蛋白(圖7)。表達(dá)蛋白經(jīng)薄層%(圖8)。定血清抗體效價(jià)。按:1100;1:2P一1多克隆抗體，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀D值的最小濃度為102400:1。
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 岳玲;hOP-1基因的克隆、多抗制備及其在真核細(xì)胞中的表達(dá)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

本文編號(hào)：2884895