A類清道夫受體(Scavenger receptor，SR-A)是一種主要位于巨噬細胞膜表面的同源三聚體糖蛋白，能夠介導多種配體進行內(nèi)移。有關(guān)SR-A內(nèi)移的調(diào)控機制目前尚所知甚少，一般認為其胞漿域部分不含引導內(nèi)移的信號序列，只有幾個潛在的磷酸化位點，但后者似乎不能完全介導受體的內(nèi)移，為深入探討A類清道夫受體胞漿域在介導受體內(nèi)移中的作用，本研究以含有SR-A cDNA質(zhì)粒為模板，采用PCR的方法擴增不含胞漿域序列的清道夫受體(以下簡稱截短型受體)，同時擴增全長清道夫受體作為對照，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化酶切后，進一步亞克隆到PcDNA3.1／HisB中，測序結(jié)果表明清道夫受體基因已經(jīng)重組到載體中，開放性閱讀框架正確，編碼的氨基酸序列無誤。將重組產(chǎn)物經(jīng)脂質(zhì)體Lipofectamine(LF2000)介導轉(zhuǎn)化入CHO細胞中，在含G418選擇性培養(yǎng)液中培養(yǎng)篩選14天后，分離陽性克隆，繼續(xù)培養(yǎng)。采用流式細胞計數(shù)儀(FACS)鑒定轉(zhuǎn)化篩選后細胞能否表達具有功能的清道夫受體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的CHO細胞可以穩(wěn)定表達SR-A的蛋白，但受體胞漿域去除后攝取配體的能力明顯弱于全長組(1：1.337)。為進一步比較兩組細胞受體內(nèi)移的改變，用熒光DiI標記乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL)37℃孵育轉(zhuǎn)化細胞5小時后，激光共聚焦顯微鏡下觀察到：全長組熒光散在分布于細胞膜和細胞器，而截短組熒光只局限于細胞膜。用熒光分光光度計定量分析受體介導配體內(nèi)移率的改變，結(jié) 南京醫(yī)科大學博士學位論文 果發(fā)現(xiàn)在與配體孵育10min、20min和40min后，全長組SR一A對 DII一acLDL的攝取率分別為26%、43 .3%和78.1%，而去除胞漿域后 DII一acLDL的攝取率則分別降至1 4.9%、17.05和14.7%，以上說明受 體胞裝域去除后受體的內(nèi)移功能明顯受到抑制，從而證明SR一A胞漿 域起著介導受體內(nèi)移的作用。此外用蛋白激酶抑制劑staurosporine (STA)和H:處理細胞，利用熒光分光光度計比較細胞內(nèi)磷酸化水平 的變化對受體結(jié)合和攝取配體的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn):STA和H7可以增 加全長組受體與配體的結(jié)合及攝取，而截短型受體不受STA和H7的 調(diào)控，說明磷酸化藥物可能是通過SR-A胞漿域發(fā)揮作用。在此基礎(chǔ) 上進一步比較胞漿域去除后對受體介導的細胞內(nèi)脂質(zhì)積聚和泡沫化的 影響，用高濃度的Ac一LDL處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)去除胞漿區(qū)的SR-A 只分布于細胞膜表面，不能介導配體一受體復合物進入胞裝內(nèi)，受體 介導的配體內(nèi)移率明顯減少，細胞內(nèi)脂質(zhì)含量下降，泡沫化細胞難以 形成。不僅如此，如將截短的SR一A轉(zhuǎn)入能正常表達SR-A的THP一1 細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞的脂質(zhì)含量明顯減少。該結(jié)果首次證明去除SR-A 的胞漿區(qū)后，可阻止泡沫細胞的形成。提示SR一A胞漿區(qū)可能是巨噬 細胞泡沫化的干預靶標。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
材料與方法
結(jié)果
討論
結(jié)論
參考文獻
致謝
綜述一
綜述二
在讀期間發(fā)表的論文目錄
在讀期間主持和參與完成的科研項目
重組于PCDNA3.1質(zhì)粒的SR-A的測序圖

【參考文獻】

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1 金艷,陳琪,王南,陳秀英,魏恩會,周春蕾,范樂明;蛋白激酶C抑制劑對U937細胞清道夫受體功能的影響[J];生物化學與生物物理學報;1999年04期

2 金艷,陳琪,魏恩會,蔣莉,范樂明,王南,陳秀英;酪氨酸蛋白激酶抑制劑genistein對PMA處理后A類清道夫受體表達的抑制[J];生物化學與生物物理學報;2001年01期

本文編號：2879284