目的 溶酶體是一個形態(tài)變化多樣的運動性細胞器，傳統(tǒng)上呈圓形或橢圓形。近來在不同類型的細胞中發(fā)現(xiàn)一種酸性磷酸酶陽性的長管狀溶酶體，稱其為線狀溶酶體(nematolysosome NLY)。超高壓電鏡觀察NLY在細胞內(nèi)以分支網(wǎng)絡結構形式存在，已有報導，NLY的形成及分布受細胞內(nèi)環(huán)境及細胞外刺激的影響。一些細胞中可見NLY借分支與圓形溶酶體相連，一般認為NLY參與細胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。大量研究證明，在機體的多種細胞如中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞、胰腺的腺泡細胞等都有NLY的廣泛存在。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也有NLY的分布，在脊髓前角的運動神經(jīng)元，其分布在胞體、軸突等，推測NLY參與神經(jīng)元的軸突運輸。 紐蛋白(vinculin)是一種細胞骨架蛋白。細胞骨架包括微絲、微管及中間絲。其中微絲主要為絲狀肌動蛋白，其由球形的肌動蛋白單體聚合而成。在細胞膜內(nèi)側(cè)，其與vinculin、talin、a-actinin和fodrin等結合構成膜骨架或粘著類型連接等結構。由于上述幾個蛋白均與肌動蛋白結合存在，又稱其為肌動蛋白結合蛋白。紐蛋白做為一個粘著連接相關蛋白，其作用是在細胞-細胞或細胞-基質(zhì)間的連接中，將肌動蛋白連接于細胞膜，其在細胞的連接、蔓延及固定中有重要的作用。同時，在細胞外信號向內(nèi)傳導方面也有作用。 溶酶體是由細胞高爾基復合體形成的以酸性磷酸酶為主要標志酶的細胞器，其作用是參與細胞內(nèi)、外物質(zhì)的吞噬與消化。此過程包括如下幾個步驟：初級溶酶體的形成、自噬和異噬的發(fā)生形成早期內(nèi)吞體、早期內(nèi)吞體酸化成熟形成晚期內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體與溶酶體結合形成自噬溶酶體(次級 溶酶體人溶酶體內(nèi)水解酶對吞噬物消化后，進行細胞內(nèi)的再利用或形成殘 余體。溶酶體在自噬及異噬過程中可呈線狀、球形或卷曲形，此過程受細胞 骨架的調(diào)節(jié)，且微絲與微管分別在不同的步驟對其進行調(diào)節(jié)。 已有報導，肌動蛋白絲主要促進內(nèi)吞體的形成及晚期內(nèi)吞體與溶酶體 的融合，此過程也有肌動蛋白結合蛋白的參與。用細胞松弛素（肌動蛋白 絲解聚劑）B或D處理細胞可見細胞內(nèi)自噬泡形成減少，認為自噬泡的形 成與微絲的聚合與解聚有關。另有報導，用細胞松弛素D處理角膜上皮細 胞可引起紐蛋白分布的改變，提示紐蛋白的分布是微絲依賴的；用佛波醇酯 澤MA）處理細胞引起線狀溶酶體的形成，也引起紐蛋白免疫熒光染色的變 化。上述研究是否提示紐蛋白與線狀溶酶體的形成有關？紐蛋白是一個粘 著類型連接相關蛋白，在異物吞噬過程中是否有紐蛋白的參與？國內(nèi)J尚 未見報導。 本實驗擬采用原代脊髓神經(jīng)細胞培養(yǎng)、免疫細胞化學、電鏡酶細胞化學 及共焦激光掃描顯微鏡等方法對脊髓神經(jīng)元紐蛋白的表達及其與肌動蛋白 絲之間的關系、線狀溶酶體的分布及其影響因素及紐蛋白與線狀溶酶體之 間的關系進行研究。從而，對神經(jīng)細胞內(nèi)細胞骨架蛋白的分布、作用及線狀 溶酶體的形成等有更深的了解；填補細胞學理論及細胞骨架蛋白該方面研 究的空白。 實 驗 方 法 1．原代細胞培養(yǎng)及施加處理因素：取出生12 h內(nèi)乳鼠，無菌取脊髓， 剪碎、消化、離心，加 DMEM制成細胞懸液，加人預先置有蓋玻片及ACLAR 膜的培養(yǎng)板中培養(yǎng)。待細胞成熟，分別向培養(yǎng)基中加人細胞松弛素D＊D 組）、PMA（PMA組）及DMSO（對照組）。 2．免疫組化ABC法及免疫熒光法染色：取長有神經(jīng)細胞的蓋玻片及 ACLAR膜，用4％多聚甲醛固定后，分別進行小鼠抗人hVIN－1的免疫組 化ABC法、免疫熒光法染色及組織蛋白酶D的免疫熒光法染色，然后進行 hVINJ的免疫電鏡顯示，以顯示紐蛋白及組織蛋白酶D在原代培養(yǎng)的脊 髓神經(jīng)元的分布。在光學顯微鏡及電子顯微鏡下觀察、照相。 3．ACP酶的光、電鏡酶細胞化學方法顯示：取長有細胞的蓋玻片及 ·二· ACLAR膜，2％多聚甲醛刀．25％戊二醛的固定液固定，ACP酶孵育液中孵 育，80分，37℃，孵育液配方采用［mori’s的方法配制，硫化胺顯色，甘油明 膠封片，光學顯微鏡觀察、照像。見陽性結果后對ACLAR膜培養(yǎng)的脊髓神 經(jīng)元進行常規(guī)電鏡標本制備，原位倒扣包埋、聚合。聚合后剝?nèi)CLAR 膜，顯微鏡下定位脊髓神經(jīng)元，超薄切片機切片，醋酸鈾單染，透射電鏡觀 察、照相。 4．免疫熒光雙標記技術：取出長有神經(jīng)細胞的蓋玻片用4％多聚甲醛 固定 15 分鐘，正常驢血清（donkey八 1：50）及羊血清（Sheep）（1：50）混勻， 封閉非特異性染色，一抗孵育：將小鼠抗人組蛋白單克隆抗體門：400）及兔 抗人組織蛋白酶抗體（工作液）混勻，滴于蓋玻片上，濕室，4℃過夜，二抗孵 育：將FITC標記的donkey－anti·－Rabbit IgG（綠）（二：50）及Texas－Red標 記的 sheep－anh－Mouse IsG紅色）（l：50）混勻，滴于藍玻片上，濕室，Zh， 室溫對W洗后，甘油一PBS封片，共焦激光掃描顯微鏡（eica TCS－SPZ，北 京醫(yī)科大學細胞所／ 643nr。雙通道激發(fā)，觀察結果，計算機存盤。 實驗結果 1．相差顯微鏡觀察 原
【學位單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2002
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

?窬??植糠糯笙允九Φ鞍自詘?誓誄釋?裱?植糽ooK圖1一16免疫電鏡顯示紐蛋白在CD處理培養(yǎng)神經(jīng)元的分布20K可見紐蛋白在細胞膜下的分布明顯減少，且胞質(zhì)及突起內(nèi)出現(xiàn)空泡(*)及斷裂。42

圖1一巧培養(yǎng)神經(jīng)元局部放大顯示紐蛋白在胞質(zhì)內(nèi)呈網(wǎng)格樣分布looK圖1一16免疫電鏡顯示紐蛋白在CD處理培養(yǎng)神經(jīng)元的分布20K可見紐蛋白在細胞膜下的分布明顯減少，且胞質(zhì)及突起內(nèi)出現(xiàn)空泡(*)及斷裂。42

圖2一5原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中ACP酶分布可見部分高爾基復合體板層呈陽性反應(t)。30K圖2一6CD處理原代培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中ACP酶陽性的溶酶體加K可見核周線狀溶酶體增多(t)。46
【共引文獻】

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本文編號：2870757