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CTLA4-Ig的表達(dá)、修飾和腫瘤免疫治療策略性研究

發(fā)布時(shí)間：2020-11-04 04:09

　　 CTLA4Ig是人CTLA4胞外區(qū)與人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)組成的融合蛋白,可以與B7結(jié)合,通過(guò)阻斷B7與CD28的結(jié)合,從而阻斷B7介導(dǎo)的T細(xì)胞活化必需的共刺激信號(hào),可作為免疫抑制劑用于器官移植。在本研究中,我們將CTLA4Ig融合分子克隆到真核表達(dá)載體pCI-dhfr,并用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染到COS7和CHO-dhfr細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染的CHO-dhfr-細(xì)胞用氨甲喋呤(MTX)進(jìn)行篩選。重組蛋白的表達(dá)用RT-PCR,ELISA,細(xì)胞免疫熒光染色和Western-blot進(jìn)行鑒定。最后采用protein A純化重組蛋白質(zhì)。 CTLA4是T細(xì)胞表面T細(xì)胞活化的負(fù)調(diào)控因子,和CD28同樣為B7分子的配體。雖然T細(xì)胞表面的CTLA-4表達(dá)非常少,其表達(dá)豐度僅為CD28的2%-3%,但CTLA-4與B7分子的結(jié)合力要比CD28與B7的結(jié)合力高20-50倍。。因此,CTLA-4具有優(yōu)先結(jié)合B7分子的特性,其作用在于傳遞陰性第二信號(hào),調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化。CTLA4Ig是人CTLA4胞外區(qū)與人免疫球蛋白鉸鏈區(qū)、CH2、CH3區(qū)組成的融合蛋白,與細(xì)胞表面的B7分子結(jié)合后,可以起到封閉作用。利用多種方法研究表明,CTLA4Ig是一種新型的人源性粘附分子類免疫抑制劑,治療以T細(xì)胞為主介導(dǎo)的移植排斥反應(yīng)是其最具潛力的應(yīng)用領(lǐng)域。另外,抗CTLA4抗體還能夠有效地用于抗腫瘤治療。本研究將CTLA4Ig融合分子克隆到含二氫葉酸還原酶(dhfr)基因的真核表達(dá)載體pCI-dhfr中,并轉(zhuǎn)染到CHO-dhfr細(xì)胞中獲得了穩(wěn)定表達(dá),為進(jìn)一步篩選高表達(dá)的工程細(xì)胞株奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2002
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

菌落PCR,酶切鑒定,陽(yáng)性克隆

用HRP一抗人Fc抗體3o7C作用45分鐘后，ECL顯也可用鼠抗人CTLA4先進(jìn)行反應(yīng)，再加入HRP一羊抗鼠gIGECL顯色體系進(jìn)行顯色。果AL4gI融合基因的克隆和鑒定真核表達(dá)載體PIGI一CTLA4Ig用EocVR和Notl雙酶切后，得LA4Ig的基因片段，包括Fe段1500bp基因和CTLA450obp的一hdrf空載體連接后，用菌落PCR法，從挑出的6個(gè)克隆中，4號(hào)三個(gè)陽(yáng)性克隆。再將陽(yáng)性克隆小量提取質(zhì)粒，以Eoc咫十結(jié)果都有CTLA4gI基因片段的插入。將其中的第3號(hào)克隆4Ig。用Qgien公司的大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒，準(zhǔn)備用于轉(zhuǎn)

PCR法,成分