本文關(guān)鍵詞：BC022687基因原核及真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：構(gòu)建BC022687（N端）的原核表達載體，誘導(dǎo)該質(zhì)粒在大腸桿菌中表達并純化表達融合蛋白；構(gòu)建BC022687（全長）基因真核表達載體，探討融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達及定位。 方法：1.以健康成年雄性小鼠的睪丸組織為來源，進行RT-PCR，建立小鼠睪丸cDNA文庫；2.以小鼠睪丸cDNA文庫為模板，PCR擴增BC022687（N端）編碼序列及全長編碼序列；3. TA克隆后測序；4.構(gòu)建BC022687（N）端原核質(zhì)粒，以pET-28a（+）原核質(zhì)粒為載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21細(xì)胞，誘導(dǎo)蛋白表達，用Western Blot鑒定融合蛋白，Ni-NTA親和層析法純化融合蛋白；5.構(gòu)建BC022687（全長）真核質(zhì)粒，以pEGFP-C1真核質(zhì)粒為載體，，并轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，誘導(dǎo)蛋白表達，Western blot及激光共聚焦驗證細(xì)胞內(nèi)BC022687（全長）融合蛋白的表達與定位。 結(jié)果：1. BC022687（N端）/pET-28a（+）原核質(zhì)粒構(gòu)建成功，獲得純化的BC022687-His融合蛋白并在大腸桿菌內(nèi)高效表達；2.構(gòu)建BC022687（全長）/pEGFP-C1真核質(zhì)粒構(gòu)建成功，重組融合蛋白BC022687/GFP在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達并定位于胞質(zhì)及中心體。結(jié)論：1.成功構(gòu)建BC022687原核及真核及表達質(zhì)粒并獲驗證其表達，為進一步研究該蛋白在精子發(fā)生中的作用奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：男性不育 BC022687 質(zhì)粒構(gòu)建 蛋白純化
【學(xué)位授予單位】：武漢科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【目錄】：

• 表1 英漢縮略詞表4-5
• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 第一章 前言9-11
• 第二章 材料和方法11-27
• 1 主要實驗材料儀器及試劑配制11-14
• 1.1 主要試劑11
• 1.2 實驗動物11
• 1.3 載體和菌株11
• 1.4 主要實驗儀器11-12
• 1.5 主要溶液試劑的配制12-14
• 2 方法14-27
• 2.1 BC022687(N 端)原核質(zhì)粒的構(gòu)建，表達及蛋白純化14-21
• 2.1.1 睪丸組織總 RNA 的提取及 RT-PCR14-15
• 2.1.2 BC022687 基因 N 端編碼序列的擴增15-16
• 2.1.3 瓊脂糖凝膠電泳16-17
• 2.1.4 PCR 產(chǎn)物純化17
• 2.1.5 TA 克隆17
• 2.1.6 TA 克隆連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化與篩選17-18
• 2.1.7 質(zhì)粒的提取與純化18
• 2.1.8 重組質(zhì)粒進行進行鑒定18
• 2.1.9 原核重組質(zhì)粒 BC022687(N 端)/pET-28a（+）的構(gòu)建18-19
• 2.1.10 BC022687(N 端)/pET-28a（+）重組質(zhì)粒的鑒定19-20
• 2.1.11 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達后 Western blot 進一步驗證20-21
• 2.1.12 6×His Tag 蛋白親和純化21
• 2.2 BC022687(全長)真核質(zhì)粒的構(gòu)建，轉(zhuǎn)染表達及定位21-27
• 2.2.1 BC022687 真核質(zhì)粒的構(gòu)建21-25
• 2.2.2 BC022687(全長)/pEGFP-C1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳細(xì)胞25-27
• 第三章 結(jié)果27-39
• 1 提總 RNA 的結(jié)果27
• 2 BC022687（N 端）原核重組質(zhì)粒的構(gòu)建，表達及蛋白純化結(jié)果27-33
• 2.1 BC022687（N 端）片段 PCR 結(jié)果27-28
• 2.2 BC022687（N 端）/pCR 2.1TA vector 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果28-29
• 2.3 BC022687（N 端）/pCR 2.1TA vector 克隆重組質(zhì)粒測序結(jié)果29
• 2.4 BC022687（N 端）/pET-28a（+）原核質(zhì)粒的雙酶切鑒定29-30
• 2.5 BC022687（N 端）/pET-28a（+）原核質(zhì)粒的測序報告30
• 2.6 蛋白含量測定結(jié)果30-31
• 2.7 SDS-PAGE 分析31-32
• 2.8 BC022687（N 端）/pET-28a（+）重組質(zhì)粒表達的融合蛋白 Western blot 分析結(jié)果32
• 2.9 原核融合蛋白的純化結(jié)果32-33
• 3. BC022687(全長)真核質(zhì)粒的構(gòu)建，表達及蛋白定位結(jié)果33-39
• 3.1 BC022687(全長)PCR 結(jié)果33-34
• 3.2 BC022687（全長）/pCR 2.1TA vector 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果34
• 3.3 BC022687 (全長)/pCR 2.1 TA vector 重組質(zhì)粒的測序結(jié)果34-35
• 3.4 BC022687 (全長)/pEFGP-C1 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果35
• 3.5 BC022687（全長）/pEFGP-C1 重組質(zhì)粒的測序結(jié)果35-36
• 3.6 BC022687（全長）/pEFGP-C1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 CHO 細(xì)胞后的 Western Blot 結(jié)果36-37
• 3.7 BC022687(全長)/GFP 融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位37-39
• 第四章 討論39-40
• 第五章 本次研究的不足40-41
• 參考文獻41-44
• 綜述44-48
• 參考文獻47-48
• 碩士期間科研工作48-49
• 致謝49

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：BC022687基因原核及真核重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：285089