研究背景： 心肌細胞在出生后就不能再生，對有絲分裂信號的反應是細胞肥大而不是增生。心肌細胞的喪失會導致所在區(qū)域心肌收縮功能減退，以致心力衰竭，壞死心肌終而被成纖維細胞形成的疤痕組織所取代。近年來，采用自體細胞和生長因子修復組織的再生醫(yī)學迅猛發(fā)展。有人將培養(yǎng)的心肌細胞移植到損傷區(qū)心肌內(nèi)能夠明顯改善心功能，并稱之為“細胞心肌成形術(shù)”(cellular cardiomyoplasty)，有可能成為治療心力衰竭的有效手段。許多作者對胚胎干細胞誘導成心肌細胞進行了大量研究，并取得了顯著進展。但是，胚胎干細胞移植仍然存在許多問題，諸如免疫排斥，倫理道德問題等。繼胚胎干細胞后，骨髓間充質(zhì)干細胞(MSC)受到了高度重視。來源于中胚層的MSC，是多能干細胞，在誘導后可以定向分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞以及肌腱細胞等多種細胞。MSC與心肌細胞同屬于中胚層。近期已經(jīng)有人應用5-氮雜胞苷(5-Aza)成功地將體外培養(yǎng)的MSC誘導成為心肌樣細胞。Tomita等將人骨髓MSC植入免疫缺陷鼠心肌后，發(fā)現(xiàn)這些細胞可分化成為心肌細胞，且表達心肌細胞特有的desmin,α-actin，β-MHC2。有作者將骨髓MSC注射入心梗邊緣部位心肌內(nèi)，這些移植的MSC分化成為心肌細胞，且受損的心功能得到明顯改善。進一步研究表明，MSC經(jīng)5-Aza誘導后分化為心肌樣細胞再行移植受損心肌部位，療效明顯優(yōu)于未誘導組。目前對于骨髓MSC定向分化為心肌樣細胞的研究處于起步階段，心肌樣細胞定向分化率仍然不高，對于心肌分化的調(diào)控機制研究甚少。因此，深入研究MSC分化過程中的調(diào)控機制對于尋求控制干細胞分化方向的手段，從而提高MSC向心肌樣細胞定向分化率，促進細胞心肌成形術(shù)的應用有重要意義。 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)作為核激素受體超家簇中的成員，是細胞分化重要的調(diào)控因子。通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達，參與調(diào)節(jié)MSC分化，并在誘導MSC分化不同特異性表型之間起到開關(guān)作用。PPARγ在MSC向心肌樣細胞分化過程中的作用如何，目前尚無相關(guān)報道。 資料顯示，Nkx 2.5、GATA4、MEF-2C等基因是調(diào)控心肌細胞分化開始階段的重 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 要轉(zhuǎn)錄因子。本文應用培養(yǎng)小鼠MSC為研究材料，以5一Aza作為誘導劑，叫睬美辛 作為PPARY的配體，利用表達載體pEGFP一1一PPA助2轉(zhuǎn)染MsC，檢測PPA助對細 胞分化及其對轉(zhuǎn)錄因子MEF一ZC、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達的影響，旨在探討PPA助 對MSC分化為心肌樣細胞的影響及其在分化過程中的調(diào)控作用。 方法與結(jié)果: 第一部分:探討了小鼠MSC的體外分離、純化、擴增、多向誘導和向心肌樣細 胞定向分化的誘導條件。首先采用密度為1.082留ml的Percou細胞分離液分離小鼠骨 髓細胞中的單個核細胞，所獲細胞應用DME樹低糖培養(yǎng)基+l0%胎牛血清進行培養(yǎng)， 通過及時、反復傳代對MSC進行純化和擴增。平均5一6d在細胞達到80%左右融合時 進行傳代。采用流式細胞儀檢測細胞周期。應用不同的誘導方法對細胞進行多向誘導 分化，使細胞向成骨細胞、成心肌樣細胞、成脂肪細胞三個不同的方向分化。誘導成 心肌樣細胞分化時選取了5一Aza3林mol/L、5林mol/L、10林mol/L三種不同濃度。應用四 環(huán)素熒光標記檢測鈣結(jié)節(jié)，油紅O染色檢測脂滴，免疫組織化學檢測ThT表達。 結(jié)果:MSC細胞形態(tài)保持均一的短梭形。12一14d細胞長成單層。細胞生長曲線: 第1、Zd細胞數(shù)量無明顯增加，第3d開始細胞數(shù)量明顯增加，MSC在第7d達到最 高峰。第8d開始進入平臺期。細胞周期結(jié)果顯示:MSC中GI期的細胞占91 .74%， S+GZ的細胞約占8.26%，表明只有少數(shù)細胞進入了活躍增殖期。成骨誘導后，細胞 出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。成脂誘導的細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。成心肌樣細胞誘導中以5-Aza 3林mol幾濃度為最佳，誘導后l月，部分細胞TnT表達陽性。5一Aza以5林mol/L及 10娜ol/L濃度誘導后雖有肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，但TnT表達始終呈陰性。 第二部分:應用叫噪美辛作為P隊RY的配體作用于MSC以激活PPA助。將細胞 分為4組:A組用5一Aza3林mol/L誘導細胞分化;B組分別采用叼}噪美辛10一、10一，mol/L 兩種不同濃度作用于MSC，觀察細胞生長情況，形態(tài)變化;C組聯(lián)用5一Aza鴻}噪美辛 作用于MsC;D組為對照組，不誘導。應用油紅一O檢測脂滴，免疫組織化學檢測PPARY 表達情況。 結(jié)果:叫噪美辛在10一mol幾濃度時對細胞有明顯的毒性，而10一smol/L時細胞生 長良好。對照組及單用10一，mol幾叫睬美辛作用Msc時，PPA助表達均呈陰性。單用 叫垛美辛并不能誘導MSC分化。單用5一Aza3卜mol幾誘導后的第3d，部分細胞PPARY 表達陽性。聯(lián)用6一Aza/叫噪美辛誘導時發(fā)現(xiàn)，誘導后第3d幾乎所有細胞PPA助表達 陽性，繼續(xù)培養(yǎng)后分化為脂肪細胞。 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 第三部分:分題卜重組表達載體pCAG一PPARYZ及pEGFP一Nl。將前者中的 PPA助2目的片段構(gòu)建入后者中。采用5’端一粘性末端一3’端平端構(gòu)建策略對目的基因 進行亞克隆，構(gòu)建成pEGFP一Nl一PPA助2表達載體。酶切鑒定與測序鑒定相結(jié)合。分 題2:經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入MSC，應用吼;:并采用休克法進 行篩選?
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

細胞即可完全融合，細胞排列仍有規(guī)則的方向性。細胞生長曲線(見圖1一l)，第1、Zd細胞數(shù)量無明顯增加，第3d開始細胞數(shù)量明顯增加，MSC在第7d達到最高峰。第8d開始進入平臺期。二、MSC的成心肌誘導培養(yǎng)(見照片4、照片5)經(jīng)5一Aza誘導后，細胞生長速度明顯減緩，以10娜of幾濃度最為明顯，5林mol/L次1112廠廠1110卜.——--一一777ttt，8}—一一一一一一一一子=一一一一-—一一知知心}III曹曹6卜一一一一.一一-一子—一一一界界}///444卜.一—一子一一一一一一一一一一一一一222卜.一-一=尸乙—一一~一.一一000Les~習一一Lreeses匕es習eseseses習eseseseses‘esesesesLeseseses‘eseses曰曰1112345678999天天數(shù)數(shù)圖圖1一1MSCs生長曲線線FFFigl一1ThegrowtheurveofMSCsss之。誘導gd后

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第三軍醫(yī)大學博士學位論文圖3-1pEGFP一l表達載體及其多克隆位點Fig3一1TheexPressionveetorPEGFP一1anditsmultiPlecloningsiteFig3一23一2pCAG一PPAR丫2表達載體TheexPressionveetorPCAG·PPAR丫2
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周進明,鄒仲敏,郭朝華,何穎,張勇,王勁,王蒙,羅成基,程天民;小鼠骨髓間質(zhì)干細胞的生物學特點及分化潛能鑒定[J];第三軍醫(yī)大學學報;2002年01期

2 王勁;DNA甲基化[J];國外醫(yī)學(臨床生物化學與檢驗學分冊);2002年04期

本文編號：2847121