發(fā)布時間：2020-10-16 03:06

　　 【研究背景及目的】 骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是來源于中胚層的骨髓非造血干細胞,具有很強的自我更新和多向分化潛能。一直以來,許多研究都在嘗試誘導中胚層的MSCs向上皮層的神經(jīng)元轉(zhuǎn)分化,方法包括:細胞因子誘導、與神經(jīng)細胞共培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)染、化學物質(zhì)誘導等。然而MSCs跨胚層分化為神經(jīng)細胞的效力不高、比例低下、缺乏神經(jīng)電生理功能、無法滿足臨床及科研的需要,限制了MSCs移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的臨床應用。誘導式多潛能干細胞再程序化技術(shù),是指通過植入新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因,改變細胞的發(fā)育“記憶”,使其返回到最原始的胚胎發(fā)育狀態(tài),并具有向各胚層分化的潛能。因此,本課題擬采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將在神經(jīng)分化中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子Neurogenin2(Ngn2)轉(zhuǎn)入大鼠MSCs,使細胞再程序化為骨髓源性ips神經(jīng)干細胞,再經(jīng)誘導定向分化為功能神經(jīng)元;并初步探索MSCs跨胚層分化的內(nèi)在分子機制,為進一步研究提供理論依據(jù)。 【研究方法】 1.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)、鑒定,攜帶Ngn2慢病毒液的制備及細胞轉(zhuǎn)染。 2.無菌條件貼壁法培養(yǎng)大鼠MSCs,擴增至第3代為實驗用,流式細胞儀鑒定大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞標記物。構(gòu)建基因重組慢病毒載體,插入綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為標記。使用高效重組載體和含有目的基因Ngn2的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞,進行病毒包裝和生產(chǎn),收集病毒液后轉(zhuǎn)染MSCs。 3.細胞因子誘導Ngn2轉(zhuǎn)染的MSCs向神經(jīng)細胞分化、鑒定。Ngn2轉(zhuǎn)染的MSCs,先給予含bFGF +EGF的無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),3天后待大部分細胞長成接近神經(jīng)細胞樣克隆,然后在細胞培養(yǎng)液中加入BDNF作神經(jīng)誘導和分化。免疫細胞化學、神經(jīng)電生理,用以鑒定分化成的神經(jīng)細胞是否具有神經(jīng)細胞功能。 4.大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元的相關(guān)機制研究已知JAK-STAT3 signaling, ERK signaling, JNK signaling等信號通路與神經(jīng)元分化密切相關(guān),采用western blot分別檢測轉(zhuǎn)基因前、后,及因子誘分化后的神經(jīng)分化相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白的表達,探索大鼠MSCs神經(jīng)分化的內(nèi)在分子機制。 【研究結(jié)果】 1.體外貼壁法培養(yǎng)大鼠MSCs,細胞貼壁生長、生物特性良好、傳代穩(wěn)定。流式細胞儀鑒定結(jié)果示:CD34 (-), CD45(-) ,CD44(+) ,CD105符合間充質(zhì)細胞特性。制備含目的基因Ngn2的慢病毒液,滴度為1×108TU/ml,轉(zhuǎn)染大鼠MSCs效率達93%左右。轉(zhuǎn)染Ngn2基因后的MSCs在培養(yǎng)液中繼續(xù)增殖,細胞克隆形態(tài)無明顯異常改變。且表達神經(jīng)前體干細胞標記物如:Nestin、Pax6、Vimentin、Musashi1。 2.骨髓源性ips神經(jīng)干細胞在體外促神經(jīng)分化因子作用下,細胞呈神經(jīng)元樣形態(tài)、免疫細胞化學檢查發(fā)現(xiàn),細胞表達成熟神經(jīng)元相關(guān)標記物:MAP2, NeuN, NSE,Western blot蛋白定量檢測也證實了免疫細胞化學結(jié)果,膜片鉗電生理也在記錄到且具有神經(jīng)元動作電位相關(guān)Na~+離子、K~+離子通道。3.Western blot蛋白定量檢測表明,經(jīng)神經(jīng)分化因子誘導后,骨髓源性ips神經(jīng)干細胞中磷酸化STAT3蛋白表達明顯低于正常水平,而磷酸化ERK、JNK蛋白表達升高。 【研究結(jié)論】 1.Ngn2基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞,可成功制備出骨髓源性ips神經(jīng)干細胞,并可誘導分化為具有神經(jīng)電生理功能的神經(jīng)元細胞。 2.骨髓源性ips神經(jīng)干細胞跨胚層分化為功能神經(jīng)細胞的分子機制,可能與抑制STAT3、增強ERK、JNK表達的信號通路有關(guān)。
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2010
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

17源性ips神經(jīng)前體干細胞（P<0.05）。（圖4，5）◆ 圖1， P3代培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，細胞呈長梭形，成纖維樣細胞，完全融合后類似形成漩渦壯結(jié)構(gòu)（倒置顯微鏡×400）CD45-FITC(-) CD34-PE(-)CD44-PE(+) CD105FITC(+)◆ 圖2 流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，通過貼壁法培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞表面標記蛋白CD34 、CD45 表達陰性;而間充質(zhì)干細胞相對特異性標志蛋白CD44，CD105強陽性表達。

◆ 圖3.培養(yǎng)至P3代的大鼠MSCs，經(jīng)含Neurogenin2的慢病毒液作用五天后，綠色熒顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的大鼠MSCs綠色熒光蛋白表達率高達93%

3代大鼠MSCs轉(zhuǎn)染空載體基因后，westernblot檢測結(jié)果示Neurogenin2蛋白
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 邢瑩;白瑞櫻;鄢文海;韓雪飛;段萍;許燕;樊志剛;;人骨髓間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)細胞分化過程中Notch通路信號分子表達的變化[J];生理學報;2007年03期

2 翁金森;劉楠;杜厚偉;陳榮華;張逸仙;王杰華;黃華品;;骨髓間充質(zhì)干細胞移植對腦梗塞大鼠神經(jīng)功能恢復及突觸素表達的影響[J];細胞與分子免疫學雜志;2008年01期

3 陶軼;李立新;傅震;胡衛(wèi)星;魯艾林;謝青松;黃保勝;史德志;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子與胰島素樣生長因子Ⅰ促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元定向分化的作用差異[J];中國臨床康復;2006年09期

4 黃保勝;李立新;謝青松;田和平;胡衛(wèi)星;傅震;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進神經(jīng)干細胞在體內(nèi)外的定向分化[J];中國組織工程研究與臨床康復;2007年37期

5 林建華,雷盛民,康德智,張志堅,余良宏,吳朝陽;靜脈注射骨髓間質(zhì)干細胞對脊髓損傷修復作用的實驗研究[J];中華骨科雜志;2005年09期

6 賈延劼;孫吉平;朱曉峰;連亞軍;王海珍;張璐;張博愛;;Notch-1在骨髓間質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)細胞中的作用[J];中華醫(yī)學雜志;2006年41期

7 謝青松;李立新;陶軼;胡衛(wèi)星;黃保勝;;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進bHLH基因的表達和神經(jīng)干細胞的定向分化[J];中國神經(jīng)精神疾病雜志;2006年06期

本文編號：2842665