腦血栓形成是最常見(jiàn)的腦血管疾病之一。常常分布在腦血管相對(duì)狹 窄、彎曲、分叉或動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的溪谷處。該疾病所引起的腦梗塞治 療效果差、病殘率高，因此目前趨向于以預(yù)防血栓形成為主。血栓形成的 三要素包括：血管壁異常、血液成分改變及血流異常。針對(duì)在這些異常因 素，只有抗血小板聚集藥物-阿司匹林和噻氯匹啶（ticlopidine）對(duì)預(yù)防 腦血栓形成有一定療效。經(jīng)大規(guī)模臨床雙盲對(duì)比試驗(yàn)證實(shí)，其有效率約 20～30％。因此如何提高預(yù)防腦血栓形成的有效率成為目前的研究熱 點(diǎn)。 在心瓣膜病合并房顫時(shí)使用阻止纖維蛋白形成的抗凝藥物（如肝素 和華法令），可降低缺血性腦血管病發(fā)病率68％～86％。說(shuō)明抗凝藥物預(yù) 防血栓形成具有顯著療效。然而上述抗凝藥物易并發(fā)嚴(yán)重的出血副作 用，臨床使用時(shí)需要嚴(yán)格監(jiān)測(cè)出凝血時(shí)間，使用不方便，未能推廣 應(yīng)用于預(yù)防腦血栓形成所致的缺血性腦血管病。 近年來(lái)，組織因子（Tissue factor，TF）在促凝中的作用日益受到關(guān)注。組 織因子是內(nèi)皮細(xì)胞膜上固有的糖蛋白，它與循環(huán)中凝血因子Ⅶ相遇，形 成TF-Ⅶa復(fù)合物，活化凝血因子X(jué)，后者促進(jìn)凝血酶形成，繼之纖維 蛋白形成，導(dǎo)致血液凝固。研究表明正�；A(chǔ)狀態(tài)下TF在腦、肺、腎、 皮膚及粘膜等重要器官的血管外層細(xì)胞大量表達(dá)，以在血管破裂時(shí)保證重 要器官及時(shí)止血。血管內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞，在基礎(chǔ)狀態(tài)下不表達(dá)TF， 使血液和血管外的TF隔離，從而保證血液流動(dòng)通暢，維持血液循環(huán)功能 正常。但在動(dòng)脈粥樣硬化的腦血管分叉或彎曲處，隨著局部切應(yīng)力顯著變 化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF，觸發(fā)局部血管內(nèi)血栓形成，是觸發(fā)動(dòng)脈硬化 血管內(nèi)血栓形成的主要始發(fā)因素之一。因此抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的TF表達(dá)是 提高預(yù)防腦血栓形成效果的主要途徑之一。 控制人 TF表達(dá)的 TF基因位于 1號(hào)染色體門(mén) pZI—22人 CDNA全長(zhǎng) 2．3 kb。其TF基因啟動(dòng)子的3個(gè)Spl肥gr刁位點(diǎn)，是切應(yīng)力誘導(dǎo)啟動(dòng)TF 基因轉(zhuǎn)錄的特異調(diào)節(jié)元件，即切應(yīng)力反應(yīng)元件（shear stress resPonsive element，SSRE人該元件在切應(yīng)力顯著降低、升高或紊流時(shí)與切應(yīng)力誘導(dǎo) 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子 Egr4和 Sp結(jié)合而激活，繼之啟動(dòng) TF基因表達(dá)。因此， SSRE與轉(zhuǎn)錄因子Egr二和Spl結(jié)合是切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TF基因表達(dá) 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一�？梢�(jiàn)阻斷SSRE激活對(duì)于抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的TF基因表 達(dá)具有重要意義。 反基因技術(shù)所利用的形成三股螺旋的寡核昔酸krghe helix－forming ，TFOL具有特異性堿基識(shí)別能力，能夠與線(xiàn)狀、松弛環(huán) 狀及超螺旋狀質(zhì)粒DNA或染色體DNA結(jié)合形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，阻止靶 DNA與調(diào)節(jié)蛋白。多聚酶、轉(zhuǎn)錄因子、甲基化酶）結(jié)合，阻止靶基因轉(zhuǎn) 錄、復(fù)制及表達(dá)。TFO是人工操縱特異基因表達(dá)的工具，寡核昔酸經(jīng)過(guò) 修飾后可直接透過(guò)生物膜，迅速分布于核內(nèi)靶基因組。己用于抗病毒、抗 腫瘤等多方面研究。本課題欲設(shè)計(jì)合成篩選在生理環(huán)境中能特異性地內(nèi)皮 細(xì)胞TF基因啟動(dòng)子區(qū)SSRE結(jié)合的TFO與SSRE結(jié)合成三鏈DNA，阻 止SSRE與切應(yīng)力誘導(dǎo)的Egr1和Spl結(jié)合，從而阻止SSRE激活，導(dǎo)致 TF基因轉(zhuǎn)錄不能啟動(dòng)，TF表達(dá)因而受到抑制，到達(dá)阻斷切應(yīng)力誘導(dǎo)的血 栓形成。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)SSRE的3個(gè)即l用grd位點(diǎn)的DNA序列，設(shè)計(jì)合 成TFO，采用電泳遷移分析篩選親和性最高的TFO、進(jìn)行硫代磷酸酯修 飾，通過(guò)同位素標(biāo)記TFO，測(cè)定其細(xì)胞內(nèi)的cpm值，確定其透膜性、耐 酶性及亞細(xì)胞分布，利用兔疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交方法結(jié)合圖像分析，以 及TF促凝活性測(cè)定初步確定 TFO的抑制效果，同時(shí)利用 F．a(chǎn)ctin和 G．a(chǎn)ctin 熒光染色確定切應(yīng)力作用的可靠性和穩(wěn)定性。主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1．TF基因啟動(dòng)子區(qū)的切應(yīng)力反應(yīng)元件門(mén)SRE）由3個(gè)Sp用grl位 點(diǎn)組成，其中第1位點(diǎn)位于（q5～＊、第二位點(diǎn)位于（七8～80X第3 ·XI· 音“ 位點(diǎn)位于＋56～68卜這些位點(diǎn)的DNA序列符合反基因技術(shù)的不典型靶序 列要求，即含有喀唆斷點(diǎn)的多聚瞟吟靶序列。根據(jù)反基因技術(shù)的堿基配對(duì) 規(guī)則，針對(duì)第 1位點(diǎn)的 DNA序列，我們?cè)O(shè)計(jì)合成了 4條 14堿基寡核昔 酸，針對(duì)第2位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了8條ZI堿基寡核苦酸，針對(duì)第3位點(diǎn)， 設(shè)計(jì)合成了 2條 15堿基寡核昔酸。經(jīng)過(guò)凝膠滯留法（EMSA）篩選，每 個(gè)位點(diǎn)分別篩選出 1條 TFO，即第一位點(diǎn)為 TI 4GTa，第二位點(diǎn)為 TZI GTa， 第三位點(diǎn)為T(mén)15GTa，可見(jiàn)均為反向GT寡核昔酸。按其親和力大小排序 為：＊1＊W拙：3．6X IO“‘峋＞T14＊W＊d：1刀X 100M）＞T15＊W＊d：1刀丫 10’M卜將篩選出的 3條反向 GT寡核昔酸進(jìn)行硫代磷酸酯修飾，其親和 力較修飾前稍有降低J條硫代反向GT寡核昔酸親和性排序分別為：Kd：2．3 X10”’M（TZIGTa－ps）＞ Kd：3．8X10”’M（T14GTa－ps）＞ Kd：l．5X10”‘M（T15GTa－ pS）與修飾前比較，其親和性分別下降6．3、3．8、0．5（倍人該結(jié)果與其 它相關(guān)研究報(bào)告結(jié)果類(lèi)?
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類(lèi)】：R329.2
【文章目錄】：
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論文正文 形成三鏈DNA的寡核苷酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
    前 言
    第一部分 TFO篩選及其修飾
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第二部分 TFO的細(xì)胞攝取率和細(xì)胞內(nèi)分布
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第三部分 切應(yīng)力對(duì)F-actin和G-actin的影響
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第四部分 硫代TFO對(duì)TFmRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)及促凝活性的影響
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第五部分 硫代TFO對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Egr-1的影響
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
結(jié) 論
致 謝
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 形成三鏈DNA的寡核苷酸對(duì)多聚嘌吟靶序列中嘧啶斷點(diǎn)的識(shí)別
    參考文獻(xiàn)
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1 江國(guó)偉,孫繼虎,王克強(qiáng),于彥錚,酈鳴陽(yáng);應(yīng)力培養(yǎng)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J];解剖學(xué)雜志;1997年03期

本文編號(hào)：2839337