睪丸的精子發(fā)生是一個獨特復雜的細胞分裂分化過程。睪丸生精小管中的生精細胞先后經(jīng)過三個階段的變化：精原細胞的增殖，精母細胞的減數(shù)分裂和精子細胞的變態(tài)過程，最終產(chǎn)生成熟的精子。許多在睪丸中特異或高度表達的基因參與這一過程。 克隆睪丸精子發(fā)生相關基因并研究其功能，對于揭示精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂和變態(tài)的分子機制，對于臨床男性不育的診斷和治療以及男性分子節(jié)育等均具有重要的意義。 為了克隆組織中表達的新基因，許多基于基因差異顯示的方法，如抑制性差減雜交(SSH)，差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR)和cDNA microarray雜交技術等已得到了應用和改進。本實驗室利用人睪丸cDNA microarray，比較了人胚胎期睪丸和成年期睪丸的基因表達差異，篩選出1522個差異表達的克隆，從中克隆了40條與睪丸發(fā)育和精子發(fā)生相關的新基因。在此基礎上，本研究從中選擇了兩條在成人睪丸高表達的新基因(睪丸特異的有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白基因(tsMCAK)和NYD-SP16基因)進行了初步的功能研究。 第一部分 tsMCAK基因的研究 有絲分裂期染色體的分離是通過紡錘體(由許多微管和相關的驅動蛋白相關蛋白組成)的動力學過程完成。在這些驅動蛋白相關蛋白中，有一類蛋白的結構中有一個位于中央的運動元結構域，在人體細胞、小鼠、倉鼠、非洲蟾蜍、硅藻等物種中均已發(fā)現(xiàn)了這個家族的成員。研究表明倉鼠和人的有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白對于染色體的 南京醫(yī)科大學博士學位論文 分離和細胞的分裂、增殖過程是必不可少的，但這類蛋白和睪丸功能 的關系尚未見報道。 本研究在人睪丸cDNA micro啊差異雜交的舢上，克隆出一 條新的成人辜丸高表達的人有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白基因 （HsMCAK）的不同剪接體。由于其在睪丸特異表達，故命名為睪丸 特異的有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白 ＊estis s耶cific MCAK， tSMCAK），是驅動蛋白相關蛋白家族中的新的一員。 tSMCAK克隆的咸人睪丸探針和胚胎睪丸探針雜交信號分別為 45．84和12．65，成人睪丸中的表達水平比胚胎睪丸高2．62倍，是成年 期睪丸高表達的基因／SMC從C洲A全長2401 hp，開放閱讀框2013 hp，編碼蛋白質(zhì)有 671個氨基酸。tsMCAK序列已輸入 GenBank，接 收號為AY026505。序列分析顯示：tSMCAK和人體細胞的HSMCAK 基固高度同源；氨基酸序列完全同源，僅比HS＊＊AK蛋白少躺端 54個氨基酸；兩者都有一個位于中央的驅動蛋白運動元結構域，且 結構域的氨基酗列兩者完全相同�；碳艚臃治鼋沂� tSMCAK基因 是HsMCAK基因在睪丸組織中的不同剪接產(chǎn)物。 tsMCAK基因定位于 IP34。人多重組織 RTPCR顯示 tsMCAK基 因僅僅在睪丸組織特異高表達，其它組織未見表達。tsMCAK基固在 生精障礙患者睪丸內(nèi)的表達結果顯示 tSMCAK基因的表蛐失與男 性不育相關，并證實tSMCAK在生精細胞特異表達。蛋白和保守結構 域的完全同源性提示睪丸中表達的tSMCAK基困的功能應該與體細 胞中HSMC膿基因的功能是一樣的，可能在精子發(fā)生過程中tSMC從 二 南京醫(yī)科大學博士學位論文 對染色體的分離和生精細胞的增殖和分裂起非常重要的作用。 總之，is＊＊AK基固是睪丸特異的驅動蛋白相關蛋白的后選基因。 tsMCAK基困在成年期辜丸生精細胞的特異高表達和睪丸的精子發(fā) 生密切相關，它的表達缺失和臨床男性不育相關。tSMCAK的確切功 能機制還有待進一步研究。 第 H部分 NYDSn 6基因的研究 一 本研究在人睪丸 cDNA microarrny差異雜交的基礎上，克隆了一 條新的成人睪丸高表達的基因，命名為 N’YD石P。 NYDEP克隆的成人睪丸探針和胚胎睪丸探針雜交信號分別 為28．16和3．78，咸人睪丸中的表達水平比胚胎睪丸高6．44倍，是成 年期睪丸高表達的基因。N’－－－E CmA全長1595 hp，含有一個 762 hp的開放閱讀框，編碼一個 254個氨基酸的蛋白質(zhì)。NYDS 序列已輸入怔nB毗，接收號為 AY027526。序列分析顯示 N’YDSP 與小鼠睪丸基因 AK006554的核菩晰列及其編碼蛋白 BAB2465 的氨基朗列有高度同源性（＞80％八表明NYDS16是一條人－小 鼠同源基因。 NYDS＊6基因定位于sql4。多重組織PCR和膜雜交結果顯示 N’YDSP基因在睪丸和胰腺高表達，其它組織很少或沒有表達。結 構域分析椎測 NYDEP蛋白含有一個跨膜結構域。通過構建綠色熒 光融合蛋白重組質(zhì)粒并轉染人緘毛膜癌JAR細胞株，結果顯示 NYDS16融合蛋白亞細胞定位于M細胞的細胞膜上，證實 3 南京醫(yī)科大學博士學位論文 NYDSP蛋白是一種膜蛋白。 不同發(fā)育階段小鼠睪丸同源基因AK006554表達水平的實時定量 PCR結果顯示＊、鼠睪丸中 AK006554 勺表達量從 1周到 4周再到 7 周是顯著增加的，可能與睪丸發(fā)育相關；7周
【學位單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

AB圖3.A:tsMCAKeDNA由20個外顯子(最短54bp，最長347bp)和19含子(最短75bp，最長4166bp)剪切拼接而成。B:tsMCAK基因定位于lpHsMCAKtsMCAK.。

南京醫(yī)科大學博士學位論文14411531GGAAAGAAAAGTCTTGGTGAATGTGTTCCAGAAGACTGGAACATAATATGCAAGATTGGTAAACAGGCAGGAGCCAGGTTGTGCAGTGCT。TGTATGeAT:下TAeTTeTAAeAGeAA;GeAAAoeeeeToAAG八應畫八AAAAAAAAAA;A從圖2.NYD一SP16。DNA的核普酸和推導的氛基酸序列。NYD一SP16的開放閱讀框架位于106一867位核普酸之間，編碼蛋白質(zhì)有254個氨基酸。氨基酸序列位于核普酸序列的下方。起始和終止密碼子以陰影所示。cDNA的第一個堿基G計數(shù)為+1。非典型的PolyA的加尾信號，AGTAAA，以方框所示。下劃線所示的核普酸為NYD一SP16多重組織PCR所用的引物序列。加陰影的氨基酸序列(143一165位氨基酸)為推導的NYD一SP16蛋白穿膜結構域的位置。AlK羹薰翼薰L羹I篡萎黔EF爵RE彝60

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本文編號：2826206