本研究選擇在中國倉鼠卵巢(chinese hamster ovary，CHO)細胞中表達具有中和 活性的抗基孔肯亞(chikungunya，Chik)病毒的嵌合抗體，以圖為Chik病的治療提供被動 免疫制劑。 為表達嵌合抗體，首先克隆具有中和活性的抗Chik病毒的鼠源單克隆抗體 (monoclonal antibody，McAb)VL和VH基因及人工gG1亞類的CH和CK基因，通過融合PCR 構建了抗Chik病毒的完整人-鼠嵌合抗體基因。將人-鼠嵌合抗體基因克隆到表達載體 的多克隆位點(mutiple cloning site，MCS)，構建了恒定區(qū)(constant region，C區(qū)) 為cDNA序列的表達質粒。 將構建的嵌合抗體表達質粒轉染CHO／dhfr-細胞，經氨甲喋呤(methotrexate，MTX) 加壓篩選，獲得最高表達量為2μg／ml的細胞株。對此細胞株擴大培養(yǎng)并純化抗Chik病 毒的嵌合抗體。純化的嵌合抗體在非還原SDS-PAGE中表現為一條約150kD的帶，在還 原SDS-PAGE中表現為一條約50kD和一條約25kD的帶；Western印跡結果顯示，全分子 蛋白和重鏈(heavy chain，H鏈)分子均可與羊抗人IgG Fc發(fā)生特異性免疫反應；全分 子蛋白和輕鏈(light chain，L鏈)分子均可與羊抗人Kappa發(fā)生特異性免疫反應。用 間接免疫熒光實驗(indirect immunofloresence assay，IFA)檢測顯示，純化的嵌合 抗體與Chik病毒抗原發(fā)生強反應，說明表達的嵌合抗體保留了親本鼠源McAb的抗原結 合活性。用不同濃度的純化嵌合抗體和鼠源McAb進行微量細胞中和實驗，結果25μg／ml 的嵌合抗體和15μg／ml的鼠源McAb可以保護細胞不出現病變，說明嵌合抗體具有與鼠 源McAb相同的生物學活性。 為了提高嵌合抗體的表達量，我們嘗試用Flp-InTM系統(tǒng)表達嵌合抗體，獲得表達量為 1μg／ml的穩(wěn)定表達細胞株。遺憾的是此系統(tǒng)不能進行基因擴增，基于此，我們構建了在 染色體的轉錄活性位點整合了FRT序列的CHO／dhfr-細胞株，命名為CHO／dhfr-FRT+。在 此細胞株中，表達了抗chik病毒的嵌合抗體，通過MTX加壓篩選，獲得表達量為5μg／ml 的穩(wěn)定表達細胞株，是Flp-InTM表達系統(tǒng)的5倍，是CHO／dhfr-表達系統(tǒng)的2． 5倍。 有報道稱，Ck基因組序列能改善抗體在CHO細胞中的表達。但未見CH基因組序列是 否較cDNA序列表達量高的報道。因此克隆人抗體分子IgG1亞類CH區(qū)基因組序列并構建 了C區(qū)為基因組序列的雙基因表達質粒，用F1p-InTM系統(tǒng)研究了C區(qū)為cDNA序列和基 因組序列對抗體表達量的差異，結果顯示CH區(qū)使用cDNA序列是基因組序列抗體表達量的 3倍。
【學位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

一IVL.和V

通過融合PCR方法擴增嵌合抗體L、H鏈基因(見圖1一4)，并將擴增產物克隆到pMD一T載體上(見圖1一5)進行DNA序列測定，結果見圖1一6。工gGI是由L鏈和H鏈組成的異源二聚體分子，含有4對鏈間二硫鍵和犯對鏈內二硫鍵，見圖1一7。我們得到的完整嵌合抗體L、H鏈基因氨基酸序列分別含有5個和n個半膚氨酸，與預期結果完全一致。12312叢二_2000—匕00250—100bP15000100007500500025001000250圖1一4嵌合抗體L?

humanlgG:4:MouseMeAbagainstChikVlrLIS圖3一4純化的嵌合抗體的Western印跡分析Fig3一4W七sternblotanalysisofthePurifiedehimerieantibody1and4:MouseMeAb;2ands:StandardhumanIgG:3and6:Purifiedehimerieantibody:4:Proteinm毗e:(人斤xlo3)2.5純化的嵌合抗體的SDS一以GE和Western印跡取2陀純化的嵌合抗體進行SDS一PAGE和Western印跡檢測，結果見圖3一3和圖3一4。在非還原SDS一PAGE電泳中，顯示一條約150kD的蛋白條帶(未顯示圖片);在還原SDS一PAGE電泳中，顯示2條帶，經過TOTALLAB軟件分析相對分子質量分別為52kD和24kD，分別與H鏈和L鏈的預期大小一致，見圖3一5。用H即標記的羊抗人工gGF。進行Western印跡實驗，結果顯示與全分子抗體和H鏈均可發(fā)生反應

【共引文獻】

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8 馬s

本文編號：2816342