背景： 研究表明心臟存在干細胞,具有自我更新和多向分化的能力。2011年及2012年國外已開展心肌干細胞用于急性心肌梗死及缺血性心肌病的臨床試驗,其中SCIPIO利用c-kit陽性心肌干細胞治療心衰,EF顯著提高；而CADUCEUS實驗利用小球(cardiosphere)治療急性心梗,局部心肌活力改善,但左室射血分數(shù)無顯著性差異。最新的動物實驗表明心肌干細胞用于治療急性心肌梗死效果優(yōu)于骨髓單個核細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞。然而,心肌干細胞的提取、分離、擴增過程周期長,較其他細胞更為復雜。建立成熟的細胞培養(yǎng)方法成為以后基礎(chǔ)研究和臨床試驗的前提條件。同時,既往的研究表明,單純輸注干細胞治療心梗后心衰效果有限,這是因為細胞駐留率不高及心肌梗死后惡劣的微環(huán)境所致。因此,提高干細胞本身的活力及改善移植后干細胞生長的微環(huán)境策略是近年研究的熱點。 目的： 1)建立從成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到c-kit陽性心肌干細胞的有效方法； 2)探索阿托伐他汀對心肌干細胞在缺氧/無血清培養(yǎng)下的作用。 方法: 1)心肌干細胞的分離培養(yǎng)和擴增：無菌條件下取2月齡成年C57BL/6小鼠心臟,PBS洗滌,剪碎,經(jīng)胰蛋白酶和膠原酶IV消化后,置于Matrigel組織塊培養(yǎng)基(complete explant medium, CEM)中培養(yǎng)。大約2周后,收集心肌組織旁爬出成纖維狀細胞板層上的小、圓、亮的細胞,接種于多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中,予以心球生長培養(yǎng)基(cardiosphere-growing medium, CGM)繼續(xù)培養(yǎng),傳代擴增后再通過磁珠分選收集純化的c-kit陽性心肌干細胞。分選前及分選后用流式細胞儀分析所得細胞其表面抗體c-kit和sca-1的表達。2)他汀對缺氧/無血清心肌干細胞的作用：分選后的心肌干細胞置于含不同濃度他汀(對照組,10-3μ mol/l,10-2μ mol/l,10-1μmol/l,1μ mol/l,10μ mol/l)的無血清心球生長培養(yǎng)基中,在缺氧12小時后觀察細胞形態(tài)的變化,用流式細胞法分析細胞凋亡比例。 緒慕: 1)心肌干細胞培養(yǎng)：消化后的心肌組織3天后可見成纖維樣細胞從組織塊兒周圍爬出,1周后可見小、圓、亮的細胞出現(xiàn)在組織塊周圍爬出的成纖維細胞層上。傳代培養(yǎng)后,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)呈較均一的梭型,可見心肌干細胞形成的“太陽狀”集落。磁珠分選可獲得分選前大約1%的細胞。流式細胞分析磁珠分選后c-kit陽性率為18.59%,sca-1陽性率為56.7%;而分選前c-kit陽性率為3.44%,sca-1陽性率為53.46%。2)他汀對缺氧/無血清干細胞的作用：高濃度他汀(1μ mol/l,10μmol/l)組較對照組鏡下觀察細胞皺縮明顯,流式細胞儀初步分析凋亡率較對照組高(對照組：20.5%,1μ mol/l:29.5%,10μ mol/l:28.2%, p0.05);低濃度他汀較對照組凋亡率(對照組：20.5%,10-3μ mol/l:19.2%,10-2μ mol/l:23.2%)不明顯。 結(jié)倫： 聯(lián)合利用酶消化和磁珠分選法可以成功從成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到c-kit陽性干細胞。他汀對心肌干細胞的作用有待進一步實驗探究。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2

【共引文獻】

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1 魯映映;李一文;;心外膜和心外膜源細胞在心臟缺血修復治療中的作用[J];國際心血管病雜志;2013年05期

2 賈竹青;周春燕;;心臟干/祖細胞與心肌損傷修復[J];中國生物化學與分子生物學報;2011年10期

3 周云鶴;;有氧運動誘導心肌肥大和心肌細胞增殖的研究進展[J];中國細胞生物學學報;2013年10期

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1 華琨;構(gòu)建基于胞質(zhì)分裂相關(guān)基因表達變化的新型心肌細胞增殖評估體系[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2013年

2 王逵;SDF-1α/CXCR4軸對心肌干細胞遷移及歸巢修復心肌的影響[D];第三軍醫(yī)大學;2013年

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1 楊萍;磷脂酰肌醇3激酶信號通路在天麻素抑制脂多糖誘導H9c2心肌細胞炎癥反應中的保護性機制研究[D];昆明醫(yī)科大學;2013年

本文編號：2813414