【摘要】：背景:一氧化氮（Nitric oxide, NO）作為重要的信號分子和效應(yīng)分子參與多種生理過程。機(jī)體通過一氧化氮合成酶（Nitric oxidesynthase, NOS）來合成NO，而誘導(dǎo)型NOS（inducible NOS, iNOS）因其具有的誘導(dǎo)表達(dá)及高效產(chǎn)生NO的特性使其成為機(jī)體免疫系統(tǒng)用來對抗入侵的微生物及清除自身腫瘤細(xì)胞的重要工具。熱休克蛋白（Heatshock protein, HSP）是細(xì)胞內(nèi)表達(dá)豐度最高的蛋白，在受到熱休克等應(yīng)激刺激時(shí)還會大量誘導(dǎo)表達(dá)。本課題組前期的研究證實(shí)HSP90對iNOS表達(dá)、活性及蛋白穩(wěn)定性有重要影響，而作為與之緊密相關(guān)的HSP70是否有相似的作用目前尚不清楚。PFT-μ (Pifithrin-mu)是由George等于2009年首次在Mol Cell上報(bào)道的對HSP70具有高度選擇性的一種小分子抑制劑，這為我們研究HSP70提供了一個(gè)有力的研究工具。到目前為止，利用PFT-μ治療白血病等癌癥方面的研究已有報(bào)道，但尚無在膿毒癥等炎癥方面的研究，另外也無HSP70與iNOS蛋白誘導(dǎo)及蛋白翻譯后穩(wěn)定性維持方面的報(bào)道。 目的:擬探討PFT-μ作為特異性熱休克蛋白70抑制劑對IFN-γ誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞NO產(chǎn)生及iNOS表達(dá)的影響及分子調(diào)控機(jī)制；觀察PFT-μ對膿毒癥小鼠主要組織內(nèi)iNOS表達(dá)的影響，觀察PFT-μ是否參與iNOS蛋白翻譯后的穩(wěn)定性。 方法:采用LPS/IFN-γ誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞株構(gòu)建炎癥反應(yīng)的細(xì)胞模型，Western-Blot檢測iNOS等蛋白表達(dá)；定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)分析iNOS mRNA表達(dá)改變，Griess試劑測定培養(yǎng)基中NO的含量；HSP70siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞檢測iNOS等蛋白表達(dá)；Western-Blot檢測轉(zhuǎn)錄因子STAT1磷酸化水平及IRF-1誘導(dǎo)表達(dá)及胞核轉(zhuǎn)移情況、染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromosome immunoprecipitate assay,ChIP）檢測p-STAT1和IRF-1與iNOS基因啟動子區(qū)的結(jié)合；Western-Blot檢測胞漿可溶性及沉淀中iNOS蛋白；構(gòu)建內(nèi)毒素血癥小鼠模型檢測主要組織內(nèi)iNOS表達(dá)水平的變化。 結(jié)果:在IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中，PFT-μ在8-12小時(shí)可抑制NO生成（P0.05）；PFT-μ在8-12小時(shí)可下調(diào)iNOS蛋白和mRNA表達(dá)（P0.05）；HSP70siRNA轉(zhuǎn)染后可下調(diào)iNOS蛋白水平；PFT-μ不影響細(xì)胞內(nèi)STAT1、磷酸化STAT1的水平，PFT-μ不影響IRF-1蛋白的表達(dá)及細(xì)胞內(nèi)胞漿與胞核間轉(zhuǎn)移；PFT-μ在2小時(shí)可降低p-STAT1和IRF-1對iNOS啟動子區(qū)的結(jié)合（P0.05）；PFT-μ不影響iNOS mRNA的穩(wěn)定性（P0.05）；PFT-μ不影響iNOS的蛋白穩(wěn)定性；PFT-μ可抑制內(nèi)毒素血癥小鼠主要組織內(nèi)iNOS的蛋白及mRNA的表達(dá)（P0.05）。 結(jié)論：PFT-μ可降低LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的RAW264.7中NO的生成、iNOS蛋白和mRNA表達(dá)；PFT-μ通過抑制轉(zhuǎn)錄因子p-STAT1和IRF-1與iNOS基因啟動子結(jié)合而減少iNOS生成；PFT-μ對iNOS mRNA及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性無影響；PFT-μ可在小鼠體內(nèi)抑制iNOS表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3416
【圖文】：

圖 1-1 LPS/IFN-γ 誘導(dǎo) RAW264.7 細(xì)胞生成 iNOS 蛋白被 PFT-μ 呈時(shí)間依賴性抑制1-1 iNOS protein expression in LPS plus IFN-γ-stimulated RAW 264.7 cells was blunT-μ. Pretreating cells with PFT-μ (20 μM) for 30 min and then stimulating with LPS/ml) plus IFN-γ (100 U/ml) at indicated time points. iNOS and GAPDH were detecteestern-Blot. GAPDH was used as an internal loading control. **, P<0.05 versus cont(LPS/IFN-γ) group, n=3. IFN-γ 誘導(dǎo) RAW 264.7 iNOS 表達(dá)可被 PFT-μ 抑制結(jié)果如圖 1-2 所示，IFN-γ 作用后，前 4 個(gè)小時(shí)幾乎無 iNOS 表達(dá)，從給后 iNOS 表達(dá)增加，到 16 小時(shí)達(dá)到最高；用 PFT-μ 預(yù)處理 30 分鐘后，達(dá)明顯減弱，幾乎看不到 iNOS 蛋白條帶�；叶戎捣治龊箫@示在 8、12 處，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖 1-2 IFN-γ 誘導(dǎo) RAW 264.7 細(xì)胞生成 iNOS 蛋白被 PFT-μ 呈時(shí)間依賴性抑制2 iNOS protein expression in IFN-γ-stimulated RAW 264.7 cells was blunted byating cells with PFT-μ (20 μM) for 30 min and then stimulating with IFN-γ (100 ted time points. iNOS and GAPDH were detected by Western-Blot. GAPDH wasan internal loading control. **, P<0.05 versus control (IFN-γ) group, n=3.PS/IFN-γ 誘導(dǎo) RAW 264.7 iNOS 基因轉(zhuǎn)錄可被 PFT-μ 抑制果如圖 1-3 所示，real time PCR 檢測 iNOS mRNA 水平變化。A 圖所刺激的 0 點(diǎn)檢測不到 iNOS mRNA 表達(dá)，2 小時(shí)后 iNOS mRNA 開始時(shí)間遞增逐漸增強(qiáng)，在試驗(yàn)觀察的時(shí)間區(qū)間內(nèi)以刺激 8 小時(shí)后表達(dá)為 100%；PFT-μ 預(yù)處理組（20 μM）iNOS mRNA 整體變化趨勢與對是表達(dá)量較同時(shí)間點(diǎn)對照組明顯減弱（P<0.05）。B 圖所示，PFT-μ50 μM，iNOS mRNA 表達(dá)完全被抑制，到 8 小時(shí)仍幾乎檢測不到 iNOS

30LPS/IFN-γ 誘導(dǎo) RAW 264.7 細(xì)胞 iNOS mRNA 轉(zhuǎn)錄可被 PFT-μ 呈時(shí)間依3 iNOS mRNA transcription in LPS plus IFN-γ-stimulated RAW 264.7 c by PFT-μ. Pretreating cells with PFT-μ (A,20 μM or B,50 μM) for 30 min ating with LPS (2 μg/ml) plus IFN-γ (100 U/ml) at indicated time points. **versus control (LPS/IFN-γ) group, n=3.S/IFN-γ 刺激 RAW264.7 產(chǎn)生 NO 可被 PFT-μ 抑制要試驗(yàn)結(jié)果見圖 1-4，組合的炎癥因子作用 4 小時(shí)內(nèi)，試驗(yàn)組（PFT NO 生成都未明顯增加；8 小時(shí)開始，兩組中 NO 生成逐漸增加FT-μ 組 NO 產(chǎn)量均低于對照組（P<0.05）。

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳吉;牛昊;;ST13和HSP70在胃息肉及胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性[J];世界華人消化雜志;2013年29期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 呂春婉;新型HSP90抑制劑抗胃癌作用及機(jī)制研究高通量篩選eIF4E抑制劑及其抗腫瘤作用研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

2 朱瑋;β-葡聚糖增強(qiáng)大鼠乳腺上皮細(xì)胞的自主防御及其機(jī)制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 李東明;重組草魚干擾素對草魚的免疫保護(hù)[D];南昌大學(xué);2013年

4 高飛;年齡相關(guān)性巨噬細(xì)胞極化對骨修復(fù)再生作用的研究[D];華中科技大學(xué);2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 闞宇;慢性痛大鼠海馬NO/cGMP/PKG信號通路在針刺累積鎮(zhèn)痛效應(yīng)中的作用分析[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2013年

2 楊璐;草魚IFN-γrel的重組表達(dá)、純化和免疫學(xué)功能研究[D];電子科技大學(xué);2013年

3 呂亞輝;布魯氏菌Omp25蛋白抑制巨噬細(xì)胞分泌TNF-α的分子機(jī)制研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

本文編號：2802034