發(fā)布時(shí)間：2020-08-22 12:47

【摘要】：PSGL-1表達(dá)細(xì)胞株的建立及其形態(tài)和生物學(xué)特性的研究 P選擇素糖蛋白配體1（P Selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1）廣泛分布于免疫細(xì)胞表面，在生物體內(nèi)可與P、L、E選擇素結(jié)合。在炎癥發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。主要表現(xiàn)為免疫細(xì)胞上的PSGL-1與炎癥部位血管內(nèi)皮上的P選擇素結(jié)合，并可在內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng)，最后透過血管壁滲透到炎癥部位。 作者構(gòu)建了人PSGL-1黑色素瘤細(xì)胞系A(chǔ)2058轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)染細(xì)胞系可在體外培養(yǎng)中長期穩(wěn)定表達(dá)PSGL-1蛋白。從培養(yǎng)板上分離培養(yǎng)單個(gè)生長的PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆，用12孔或24孔板擴(kuò)大培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至足夠數(shù)量，取部分細(xì)胞以小鼠抗人PSGL-1抗體做WESTERN BLOT 篩選。取PSGL-1高表達(dá)細(xì)胞做擴(kuò)大培養(yǎng)。野生型PSGL-1分子由兩個(gè)120KD同源雙體通過二硫鍵連接而成，總分子量240KD。用非變性條件電泳，A2058PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液樣品可見240KD處明顯小鼠抗人PSGL-1抗體陽性雜交帶（附錄一fig 1左圖 ）。用變性條件電泳，A2058PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液樣品則可見120KD處明顯小鼠抗人PSGL-1抗體陽性雜交帶。對(duì)照A2058pCDNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液樣品無PSGL-1抗體陽性雜交帶。小鼠抗人PSGL-1抗體免疫組織化學(xué)染色可見細(xì)胞表面棕黃色陽性染色。對(duì)照的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈陰性染色（見附錄一fig 2） 與轉(zhuǎn)染pCDNA3載體 A2058細(xì)胞系相比，在形態(tài)學(xué)方面，轉(zhuǎn)染PSGL-1后的細(xì)胞形態(tài)改變較大，由轉(zhuǎn)染前細(xì)胞較長、形態(tài)伸展變?yōu)?WP=58 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞較短、較不伸展，免疫細(xì)胞化學(xué)染色也顯示了同樣的結(jié)果；低密度培養(yǎng)的PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞，生長細(xì)胞呈三角形伸展?fàn)顟B(tài)。與pDNA3載體轉(zhuǎn)染A2058細(xì)胞或未轉(zhuǎn)染A2058細(xì)胞系相比胞體較小。（見附錄一fig 3、4右圖）高密度培養(yǎng)細(xì)胞鏡下可見單個(gè)細(xì)胞形態(tài)同細(xì)胞低密度培養(yǎng)形態(tài)。生長細(xì)胞間彼此沒有覆蓋。接觸的細(xì)胞間有明顯邊界，接觸緊密。（見附錄一fig5右圖）而低密度培養(yǎng)的正常A2058細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pCDNA3載體 A2058細(xì)胞系，生長細(xì)胞呈梭形或長梭形伸展?fàn)顟B(tài)。（見附錄一fig3左圖，中圖。fig4左圖，中圖）高密度培養(yǎng)細(xì)胞，鏡下可見單個(gè)細(xì)胞形態(tài)同細(xì)胞低密度培養(yǎng)形態(tài)。生長細(xì)胞可彼此覆蓋，生長方式紊亂。接觸的細(xì)胞間沒有邊界。將A2058 PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞混合培養(yǎng)，觀察在相同培養(yǎng)條件下兩者生長形態(tài)是否有差別。小鼠抗人PSGL-1抗體免疫組織化學(xué)染色可見三角形棕黃色陽性染色細(xì)胞和梭形陰性染色細(xì)胞。（見附錄一fig 6） 在細(xì)胞黏附性方面，把A2058 PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)蛋白聚糖聚合物Versican G3片段及Fibronectin黏附能力相比較比較表明，A2058 PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)板中G3片段及Fibronectin包被的區(qū)域有特異性黏附，而載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞沒有這種特異性黏附。（附錄一fig9） A2058 PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移能力與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比明顯減弱。在18小時(shí)組、24小時(shí)組，載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移到空白區(qū)的細(xì)胞數(shù)量明顯高于A2058 PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。（附錄一fig11，fig12,fig13） Western Blot 分析結(jié)果表明，兩種細(xì)胞在以下蛋白分子的表達(dá)上沒有區(qū)別：整合素β1、整合素α5、α3、Syk、整合素αv ,E-Cadherin、collagen 1。（附錄一fig14，fig15,fig17） A2058 PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞與載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比較表達(dá)水平升高的蛋白分子有：N-Cadherin, β-catenin （附錄一fig17） WP=59 用免疫熒光染色比較兩種細(xì)胞ACTIN表達(dá)水平，兩種細(xì)胞ACTIN表達(dá)水平?jīng)]有明顯差別。（fig18） 作者構(gòu)建的PSGL-1 A2058表達(dá)細(xì)胞株，可在體外培養(yǎng)中長期穩(wěn)定地表達(dá)PSGL-1蛋白，凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)，其表達(dá)水平不受影響。我們?cè)谕瓿申栃约?xì)胞克隆篩選后，繼續(xù)用篩選時(shí)的藥物濃度（1000ug/ml G418）培養(yǎng)細(xì)胞，而不按照常規(guī)操作將藥物篩選濃度減半，可能是使細(xì)胞一直保持轉(zhuǎn)染蛋白長期穩(wěn)定表達(dá)的原因之一。 有文獻(xiàn)報(bào)道，細(xì)胞表面表達(dá)的PSGL-1分子和細(xì)胞的微管、微絲相關(guān)，而微管、微絲和細(xì)胞的形態(tài)學(xué)關(guān)系密切。 在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染PSGL-1的細(xì)胞形態(tài)學(xué)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞相比，細(xì)胞由伸展較大的梭形變?yōu)樯煺馆^小的三角形。 PSGL-1對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響有兩種可能途徑：一是直接影響，既PSGL-1本身即是形態(tài)相關(guān)分子，其在細(xì)胞膜上的表達(dá)與否直接影響細(xì)胞形態(tài)。我們構(gòu)建了特異性SiRNA，用以封閉PSGL-1在小鼠巨噬細(xì)胞系SAW273.1中的表達(dá)，觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化。目前實(shí)驗(yàn)尚未完成。有文獻(xiàn)報(bào)道,白細(xì)胞中PSGL-1細(xì)胞漿功能區(qū)可通過Syk蛋白與actin連接蛋白(moesin,ezrin)相聯(lián)接，(Ana,U.,M.S.Juan.2002)。我們考慮是否PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否上調(diào)sky表達(dá)進(jìn)而影響到actin表達(dá)，后者使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化.試驗(yàn)結(jié)果表明,Syk蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)沒有差別. PSGL-1對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響另一個(gè)途徑是間接途徑，細(xì)胞表達(dá)PSGL-1后對(duì)其他分子的表達(dá)水平產(chǎn)生影響，后者使細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化。在實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞N-Cardherin 表達(dá)水平升高。N-Cardherin分子可通過β-catenin連接actin,此三者和細(xì)胞間的連接、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和形態(tài)關(guān)系密切（Margaret,J.2003)。Western blot結(jié)果也表明, β-catenin在PSGL-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞中表達(dá)顯著升高.但在兩種細(xì)胞中actin表達(dá)水平?jīng)]有明顯差別,因此，細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

吉林大學(xué)博士學(xué)位論文氨基酸轉(zhuǎn)換酶切割。成熟蛋白的細(xì)胞外區(qū)開始于第 42 個(gè)氨基酸，有許多粘蛋白的特征。它富含絲氨酸、纈氨酸、脯氨酸，還包括 15 個(gè)10 個(gè)氨基酸一組的重復(fù)序列。三個(gè) N 末端的 46、48、51 位酪氨酸位于一段陰離子序列中，使其易于發(fā)生酪氨酸磷酸化。一個(gè)單個(gè)的細(xì)胞外半胱氨酸連接到跨膜區(qū)，跨膜區(qū)之后是一個(gè)由 69 個(gè)氨基酸組成的胞漿區(qū)。小鼠的 PSGL-1 分子量大小和人的相似，同樣也有一個(gè)信號(hào)肽、前導(dǎo)肽、靠近跨膜區(qū)的單個(gè)半胱氨酸，但其 N末端只有兩個(gè)酪氨

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本文編號(hào)：2800704