【摘要】：第一部分沉默Robo1對小鼠骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響 目的：研究Robo1對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖的影響。 方法：體外培養(yǎng)小鼠BMSCs,構(gòu)建siRNA載體,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染BMSCs,靶向沉默Robo1, QPCR和Western blot法驗證沉默效率,MTT和Brdu法檢測沉默Robo1基因后對BMSCs增殖的影響。 結(jié)果：Robo1-siRNA轉(zhuǎn)染BMSCs后,Robo1基因表達(dá)量相較于對照組Con-siRNA下調(diào)3倍左右,而且Robo1蛋白的表達(dá)水平相較于Con-siRNA組也明顯下調(diào)；Con-siRNA和Robo1-siRNA分別轉(zhuǎn)染BMSCs, MTT及Brdu法檢測結(jié)果顯示使用siRNA沉默Robo1基因的BMSCs細(xì)胞生長受到顯著抑制, 結(jié)論：Robo1與BMSCs生長密切相關(guān),在Robo1被沉默后,BMSCs生長受到明顯抑制。 第二部分靶向調(diào)控Robol的miRNAs的篩選及鑒定 目的：篩選及鑒定靶向調(diào)控Robol的miRNAs。 方法：用Targetscan、miRNAda等軟件進行預(yù)測,以及文獻查詢,篩選出最有可能靶向抑制Robo1的miRNAs,并用miRNAs的mimic處理細(xì)胞,Western blot檢測BMSCs中Robo1的表達(dá)差異,找到能明顯引起Robo1變化的miRNA。最后用雙熒光素酶報告基因法驗證miRNA對Robo1的靶向調(diào)控作用。 結(jié)果：利用生物信息學(xué)軟件對Robol可能的靶miRNAs進行了分析,從眾多的靶miRNAs中篩選出最可能的靶miRNAs:miR-218、 miR-29、miR-146、miR-148、分別用miR-218、miR-29a、miR-146和miR-148mimics通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染BMSCs, Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-29a時,Robol下調(diào)最為明顯。在轉(zhuǎn)染克隆有野生型Robo13’-UTR質(zhì)粒的實驗組中,檢測熒光素酶活性顯示miR-29組與空白組比較P0.01; miR-29組與陰性對照組比較P0.01,表明miR-29能與Robo1的3’-UTR結(jié)合,從而抑制螢光素酶的活性；而在轉(zhuǎn)染克隆有突變型mutRobo13'-UTR質(zhì)粒的實驗組中,miR-29組與空白組和陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,表明miR-29不能與mutRobo13’-UTR結(jié)合而抑制螢光素酶的活性。 結(jié)論:miR-29a通過與Robo1的3'-UTR結(jié)合而靶向抑制Robo1。 第三部分miR-29a靶向調(diào)控Robol抑制BMSCs增殖 目的：研究miR-29a靶向調(diào)控Robo1表達(dá)對BMSCs增殖的影響。 方法：采用慢病毒載體介導(dǎo)的miR-29a,根據(jù)miRNAbase上公布的pri-miR-29a的序列,合成并構(gòu)建在慢病毒骨架質(zhì)粒中,繼而和慢病毒的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細(xì)胞(293T,人胚腎細(xì)胞)進行慢病毒包裝,繼而裂解細(xì)胞,純化帶有pri-miR-29a的慢病毒顆粒,用于感染細(xì)胞并進行檢測增殖的細(xì)胞實驗。 結(jié)果：本實驗成功構(gòu)建和包裝miR-29a'慢病毒,然后選用BMSCs的代表株,通過MTT和Brdu法證明,過表達(dá)miR-29a可抑制BMSCs的增殖能力。real-time PCR和Western blot結(jié)果證明Robo1轉(zhuǎn)染BMSCs后,Robol表達(dá)量顯著上調(diào),過表達(dá)Robol組可增強BMSCs增殖能力,而共轉(zhuǎn)染miR-29a和Robo1可回復(fù)miR-29a對BMSCs增殖能力的抑制作用。 結(jié)論：miR-29a可通過靶向抑制Robo1的表達(dá)而抑制BMSCs的增殖。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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本文編號：2799876