【摘要】：脂多糖是革蘭氏陰性細(xì)菌主要的表面成分，由內(nèi)到外包括類脂A、核心多糖和O-抗原。O-抗原是細(xì)菌細(xì)胞最主要的表面抗原，為由重復(fù)的寡糖單位組成的多聚糖，每一種細(xì)菌都有種類不同的O-抗原存在，形成了自然界中最為突出的生物多樣性，編碼合成這些多糖的酶的基因簇成為在DNA水平上研究分子進(jìn)化的最好的材料。O-抗原的多樣性對細(xì)菌在人或動物體中的生存有極其重要的作用，同時也是在漫長的進(jìn)化過程中壓力選擇的結(jié)果。通過對其多樣性產(chǎn)生的遺傳基礎(chǔ)和進(jìn)化的研究可以揭示致病菌的進(jìn)化和形成機(jī)理。 在世界上首次對有特殊進(jìn)化地位的鮑氏志賀氏菌13型O-抗原的遺傳、結(jié)構(gòu)和進(jìn)化進(jìn)行全面的研究。研究結(jié)果表明它的O-抗原的主鏈上有罕見的糖磷酸鍵，具有酸不穩(wěn)定性。第一個基因的上游的殘余的IS的存在和3′端部分序列的較高的相似性暗示至少它的部分序列起源于霍亂弧菌O37，也與大腸桿菌O163的親緣關(guān)系近。 通過對大腸桿菌O52 O-抗原的遺傳和結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn)，它是一個依賴于ABC-2轉(zhuǎn)運(yùn)子合成的由異源雙糖組成的O-抗原，而且合成它的基因簇定位于galF和gnd基因之間。這在世界上屬于首次發(fā)現(xiàn)。我們又通過缺失和互補(bǔ)方法及SDS-PAGE和銀染技術(shù)鑒定了wzm基因和糖基轉(zhuǎn)移酶基因orf16，并證實(shí)了wzm基因的存在和orf16已經(jīng)失去了功能。又進(jìn)一步預(yù)測了單糖D-Fucf的生物合成途徑。 當(dāng)破譯了鮑氏志賀氏菌10型的O-抗原基因簇后，發(fā)現(xiàn)它與鮑氏志賀氏菌6型的整個O-抗原基因簇序列有99.8-100％的相同性。進(jìn)一步對它的O-抗原的結(jié)構(gòu)、遺傳和進(jìn)化及致病菌形成機(jī)理進(jìn)行研究，首次發(fā)現(xiàn)一個完整的基因簇的橫向轉(zhuǎn)移是由一個IS插入到重要的功能基因內(nèi)引起，也發(fā)現(xiàn)了一株進(jìn)化歷史最短的志賀氏菌：鮑氏志賀氏菌6型，是在距今不到1萬年才從鮑氏志賀氏菌10型進(jìn)化而來。 普遍認(rèn)為志賀氏菌起源于大腸桿菌，但是對痢疾志賀氏菌3型和大腸桿菌O164的進(jìn)化關(guān)系和致病菌形成機(jī)理的研究揭示出一個特例，就是大腸桿菌O164是在近期從痢疾志賀氏菌3型進(jìn)化而來。而且通過序列的精確比對發(fā)現(xiàn)由于2個堿基的插入造成移碼突變，導(dǎo)致重要功能基因缺失，產(chǎn)生了新的O-抗原，形成了新的致病菌：大腸桿菌O164--一株能引起爆發(fā)流行的EIEC。 也研究了O-抗原結(jié)構(gòu)很相似的大腸桿菌O56和O24的進(jìn)化關(guān)系，基因的同源性較高，表明它們的進(jìn)化關(guān)系密切。缺失了這兩個菌的wzx、wzy基因和O24中預(yù)測不出功能的orf9基因，并在同一菌中進(jìn)行了相應(yīng)基因的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)。表明它們都是有功能的。 志賀氏菌是隨著人類進(jìn)化而形成的非常重要的致病菌，和大腸桿菌有非常近的親 南開大學(xué)博士畢業(yè)(學(xué)位)論文 之 碑 緣關(guān)系，本文通過對具有相同O一抗原結(jié)構(gòu)的4對志賀氏菌與大腸桿菌序列分析發(fā)現(xiàn)， 它們的序列相似性很高，具有相同的基因相同的排列順序。進(jìn)一步證實(shí)志賀氏菌屬應(yīng) 被劃入致病性的大腸桿菌屬更合適。此外，發(fā)現(xiàn)二IB基因也是細(xì)菌橫向轉(zhuǎn)移的一個同 源重組位點(diǎn)。對鮑氏志賀氏菌2型和大腸桿菌054序列的破譯和分析發(fā)現(xiàn)2切了C基因很 特殊，它遠(yuǎn)離另三個基因二IBI萬1位于基因簇的3‘端。同樣的情況出現(xiàn)在鮑氏志賀氏菌 9型中，這意味著柳了C在這三個菌中是一個重組位點(diǎn)。這兩個結(jié)果使我們對同源重組 位點(diǎn)有更新的認(rèn)識。那就是一翻了雙必盆C是細(xì)菌O一抗原基因簇同源重組頻繁的區(qū)域，但 在不同的菌中，重組位點(diǎn)會發(fā)生改變。 本研究中有10個菌有二nB和二刀c，加上本實(shí)驗(yàn)室己經(jīng)破譯及網(wǎng)上搜索到的大腸 桿菌的二nB和二刀C基因序列做進(jìn)化樹。這是第一次在大腸桿菌中對朋nB和二nC基因 進(jìn)行系統(tǒng)分析。使我們對*nB和~C的起源和介導(dǎo)的DNA的橫向轉(zhuǎn)移有更深刻的認(rèn)識。 大腸桿菌01360一抗原中含有非常罕見的人體內(nèi)很需要的單糖Pseudaminic acid 的同類糖。大腸桿菌0136是一株EIEC，與另兩株EIEC大腸桿菌0164和0124有血清 交叉反應(yīng)，我們破譯它的序列后，通過同源性搜索鑒定了它的合成酶基因，并通過缺 失和互補(bǔ)對仲冬廠進(jìn)行鑒定。 本研究破譯的多個基因簇中都含有插入序列，發(fā)現(xiàn)這些插入序列可以分成兩類: 一類是插入到O一抗原基因簇的重要功能基因中，導(dǎo)致基因缺失，產(chǎn)生新的O一抗原，形 成新的致病菌。如:鮑氏志賀氏菌6型，大腸桿菌0164的IS，而且它們都是在很近的 時期形成的，這種插入序列很少見。另一類是插入到O一抗原基因簇的ga1F和第一個 基因之間，如鮑氏志賀氏菌13型和大腸桿菌056中的1S，大腸桿菌088和0161中的 H一reapeat。暗示這類插入序列能通過同源重組介導(dǎo)DNA的橫向轉(zhuǎn)移。所以，我們的結(jié) 果也表明插入序列在細(xì)菌O一抗原的進(jìn)化和致病菌的形成中扮演重要角色。 總之，本研究破譯了9株志賀氏菌和巧株大腸桿菌的O一抗原基因簇的全序列，通 過對它們的遺傳和進(jìn)化的研究和通過合作對重要或特殊的O一抗原結(jié)構(gòu)的研究及通過缺 失和互補(bǔ)方法并結(jié)合SDS一PAGE和銀染技術(shù)對重要基因的鑒定，共同診釋了志賀氏菌和 大腸桿菌0一抗原基因簇的遺傳特征，揭示了致病菌的進(jìn)化和形成機(jī)理，也使我們對志 賀氏菌和大腸桿菌的關(guān)系有了更清楚的認(rèn)識。也表明DNA的橫向轉(zhuǎn)移是細(xì)菌表面多糖抗 原基因簇進(jìn)化的重要途徑。這是世界上首次如此系統(tǒng)的
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R378
【圖文】：

}遭啄畫蔽一奮刁圖IK5的K一抗原的合成模型圖2K5的K一抗原的基因簇3.合成大腸桿菌K一抗原的基因簇合成大腸桿菌K一抗原的基因在染色體上也是成簇排列，在組1和4中稱為cPs(eapsuzegenecluster)，位于。一抗原基因簇上游的JuMstart序列之前〔65〕，也就是

}遭啄畫蔽奮刁圖IK5的K一抗原的合成模型圖2K5的K一抗原的基因簇3.合成大腸桿菌K一抗原的基因簇合成大腸桿菌K一抗原的基因在染色體上也是成簇排列，在組1和4中稱為cPs(eapsuzegenecluster)，位于。一抗原基因簇上游的JuMstart序列之前〔65〕，也就是挨著O一抗原基因簇。在組2和3中稱為kPs，圖2列出K5的K一抗原基因簇。圖3為組1和大腸桿菌K12的K一抗原基因簇:廳舊‘rstralnscaayaf]lse婦mont口胡了打劃刀昭日怕50刁2腳心切。幣旋哪幻嘆陽用口按翔”婦nk時妙I(lǐng)s自協(xié)汀舊門污·食勸歸沁卯。eS喇魷‘口p了岡比污翩ke戶舊偽腳鄺Iorg的中，翻p，“招‘。洲m.八日C時叫時l破IF尹E.COIISt沮insWithgroupIK朗tigens動叻時，~，孤，伽，~印s(GROUP1CPSBIOSYNTHESIS)而舊印口9峨NTIGENHISTIDINEeIOSYNTHESIS)BIOSYNTHESIS

了大腸桿菌056的甲z了和~，突變菌株都不在產(chǎn)生正常的LPS。缺失了�；虻耐蛔兙闔1097只產(chǎn)生核心寡糖和類脂A，缺失了班足y基因的突變菌株H1096只產(chǎn)生類脂A加核心寡糖加一個O一單位(見圖4A)。用含有大腸桿菌056的分邁獷基因的表達(dá)質(zhì)粒pLWIOOS和~基因的表達(dá)質(zhì)粒pLWIOOg分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌056的缺失突變菌株后得到互補(bǔ)菌Hll02和HllO3，電泳表明互補(bǔ)菌產(chǎn)生正常的LPS(見圖4B)。這些結(jié)果表明大腸桿菌056的邵邏獷和~基因是有功能的，鑒定了口2，f濘是甲藝了，口廠廠夕是二x基因。

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本文編號：2794622