【摘要】：登革病毒感染是一種蚊傳播疾病，主要流行于熱帶、亞熱帶地區(qū)。在臨床上，登革病毒感染可引起登革熱、登革出血熱或登革休克綜合癥。近年來，登革熱、登革出血熱或登革休克綜合癥的發(fā)病率不斷升高，全球每年有大約0.8～1億登革熱和25～50萬登革出血熱或登革休克綜合癥患者。對登革病毒感染目前尚無有效的預防及治療措施，對患者進行早期診斷是監(jiān)控登革熱流行和控制疾病發(fā)展的有效措施。 近年來國際上興起的一種新型基因檢測技術——基因芯片技術，為登革病毒感染的早期診斷提供了一種快速、高效、敏感、經(jīng)濟、自動化的方法，并可同時進行登革病毒基因的檢測和分型。 在分類上，基因芯片基本上可分為cDNA芯片和寡核苷酸芯片兩種。本論文針對登革病毒感染研制可用于登革病毒基因早期診斷的cDNA芯片和寡核苷酸芯片。 cDNA檢測芯片采用cDNA文庫法收集探針：以2型登革病毒16681株的cDNA質粒為材料，利用長片斷PCR技術擴增2型登革病毒的全長cDNA，Sau3A Ⅰ酶切長片段擴增產(chǎn)物，利用耐熱性DNA聚合酶對酶切后形成的粘性末端進行補平加A；純化補平加A產(chǎn)物，將其克隆到T載體上。對克隆進行PCR鑒定，結果獲得142個陽性克隆。采用巢式PCR擴增制備探針，用PixSys 5500型基因芯片打印儀將探針點樣到氨基硅烷包被的玻片上，制備登革病毒cDNA檢測芯片。通過對逆轉錄及馬文麗、鄭文嶺等建立的RD技術兩種標記方法的比較分析，結果顯示采用RD技術標記的樣品，獲得的雜交信號強，靈敏度高，故在后續(xù)的雜交分析中均采用此標記方法。在42℃、52℃、62℃三種不同的雜交溫度條件下，分別將登革病毒cDNA芯片與人DNA及大腸桿菌DNA雜交，摸索到能減少非特異性雜交、提高芯片檢測特異性的62℃高溫雜交體系。在此雜交體系下，cDNA芯片與登革病毒樣品雜交均有較強的陽性雜交信號，根據(jù)較特異的雜交圖譜，可實現(xiàn)對登革病毒基因的有效檢測。同時用登革病毒cDNA芯片與人基因組DNA、大腸桿菌DNA、丙肝病毒cDNA和乙腦病毒cDNA進行非特異性雜交分析，篩選到8個特異的登革病毒探針，擬作為針對多種病原體檢測的集成芯片探針。進一步將9份登革病 毒廣東地方分離株樣品與登革病毒cDNA芯片雜交:進行重復性實驗臉一 證，結果均能得到雜交信號較強的陽性結果， 革病毒基因檢測的可靠性。 初步證實了該芯片用于登 寡核昔酸芯片的制備方法有原位合成法和合成點樣法兩種，原位合 成法有嚴格的專利限制，故采用合成點樣法制備登革病毒寡核營酸芯片。 首先利用在線的BLAST檢索程序分別對4種型別登革病毒序列進行同源 性分析，找出各型登革病毒的特異性序列區(qū)段，然后遵照探針設計的一 般原則，采用生物學軟件011906.0在特異性區(qū)段篩選長度為60bP的寡核普 酸探針，使各探針的GC含量、Tm值、發(fā)夾結構等重要參數(shù)盡量趨于一 致。考慮到樣品標記時，需行Sau劃I酶切消化，因而我們在設計探針 的過程中也進行了Sau 3AI酶切位點分析。最終我們設計了22條60一mer的 登革病毒寡核營酸探針。人工合成寡核普酸探針，用Pixsys 5500型基因 芯片打印儀將探針打印、固定在多聚一L一賴氨酸包被的DAKO玻片上。應 用RD一技術標記各型登革病毒樣品及人基因組DNA，然后分別與寡核普 酸芯片進行雜交，雜交結果顯示:人基因組DNA與芯片無非特異性雜交， 而各型登革病毒樣品與芯片均有特異性雜交，且各型登革病毒樣品只與 自身相應的型特異性探針雜交，不與其它型別的檢測探針雜交，說明寡 核普酸芯片的特異性高，可用于登革病毒基因的檢測和分型。
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346
【圖文】：

二、結果1.長片斷PCR擴增2型登革病毒全長cDNA圖1一4為長片斷PCR擴增2型登革病毒全長cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果。可以看出擴增產(chǎn)物為特異的單一條帶，其片斷大小與預期相符，約10.7kb。M1以以漢0(5八U，獷5J.J工.25(1OC圖1一4長片斷PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖Fig.l一4:0.6%agarosegelelectroPhoresisoflongPCRProductsofdenguevirus2.LaneM:DL2000marker;Lanel:longPCRProduets.2.2型登革病毒cDNA文庫的構建長片斷PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Sau3AI酶切、AT克隆得到的白色菌落經(jīng)擴大培養(yǎng)后，用pMD18一T載體引物50100、50101進行PCR擴增，并用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定，結果可見分子質量不同的DNA條帶(見圖1一5)。通過PCR初步鑒定方法，共篩選到142個克隆片段大小為100~1000bp的陽性克隆。

用ABIPRIsMTM310自動測序儀對部分陽性克隆片段進行序列分析，將所得序列分析結果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，結果證明陽性克隆均來自于2型登革病毒。圖1一6為其中一個克隆片斷的測序結Fig.l一6SequencingofoneofeDNAfragmentsfromDenguevirus2elones·

M12345678910111213八U八Un甘n甘﨑h汽U50710內(nèi)乙1圖1一5克隆的PCR鑒定電泳圖Fig.1一5:PCRidentifieationofdenguevirusserotyPe2eDNAfragmentselones.3.克隆片段的序列測定與Genebaxlk同源性比較用ABIPRIsMTM310自動測序儀對部分陽性克隆片段進行序列分析，將所得序列分析結果與GenBank數(shù)據(jù)庫進行Blast序列比對，結果證明陽性克隆均來自于2型登革病毒。圖1一6為其中一個克隆片斷的測序結

【引證文獻】

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1 馬孟根;豬源致病性沙門氏菌耐藥基因PCR和基因芯片檢測技術研究[D];四川大學;2005年

本文編號：2786623